固、液态发酵培养灵芝多糖的性质、活性对比分析

摘要

灵芝是一种珍贵的药、食两用真菌，具有补中益气、滋补强体、延年益寿等功效。灵芝多糖是其主要活性成分，具有清除自由基、抗氧化、抗衰老和免疫调节等作用，其主要是从液态发酵的发酵液和固态发酵的子实体中提取得到的。本文初步研究了灵芝液态发酵产胞外多糖的培养工艺，并对液态发酵胞外多糖(GLEP)与固态发酵子实体胞内多糖(GSIP)的分离纯化、结构性质以及抗氧化、抗疲劳功能等方面进行了对比分析，主要研究结果如下:
　　(1)通过单因素实验和响应面实验对灵芝液态发酵产胞外多糖的发酵工艺进行了优化。实验结果表明，产GLEP的最适培养基组成和培养条件是:葡萄糖39 g/L、酵母粉21g/L、KH2PO43.0 g/L、MgSO4·7H2O1.0 g/L，初始pH6.0，接种量10％。在此发酵条件下实际的GLEP产量最大值为2.65 g/L，接近预测值2.74 g/L。
　　(2)利用DEAE-650离子交换树脂和葡聚糖凝胶G-100树脂对两种多糖GLEP和GSIP进行分离纯化，分别得到纯度较高的单一组分GLEP-1和GSIP-1;紫外光谱和红外光谱扫描结果显示GLEP-1和GSIP-1均不含有核酸、蛋白质和色素等杂质，且在4000～400 cm-1区间内具有多糖类物质的一般特征，均为β-型吡喃多糖;GC-MS分析结果表明GLEP-1和GSIP-1均由核糖、鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖等7种单糖组成;HPGFC法测定结果显示其分子量分别为2150Da和2606Da。
　　(3)采用DPPH和羟基自由基清除实验、还原能力测定和酵母细胞氧化损伤模型等方法，考察了两种粗多糖样品GLEP和GSIP的体外抗氧化活性。结果表明:GLEP和GSIP均具有较高的抗氧化能力。GLEP和GSIP多糖样品浓度为5.0 mg/mL时，DPPH自由基的清除率分别为50.5％和85.5％，羟基自由基清除率分别为80.7％和78.3％，还原能力分别为1.25和1.46;样品浓度为20 mg/mL时，紫外损伤酵母细胞的存活率分别为57.1％和84.3％，H2O2损伤酵母细胞存活率分别为49.1％和79.3％。
　　(4)由动物抗疲劳实验结果可知，GLEP和GSIP安全无毒，且抗疲劳效果较好。小鼠游泳衰竭实验及其抗疲劳生化指标实验测定表明，GLEP和GSIP有效地延长小鼠游泳衰竭时间;能够维持机体糖原水平延长机体运动耐力;可以增强机体SOD和GSH-Px的活性;降低血清中MDA的含量。但是对LD的含量和LDH的活性无显著影响。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 灵芝

1．1．1 灵芝简介

1．1．2 灵芝的形态特征

1．1．3 灵芝的活性成分

1．1．4 灵芝的药理作用

1．2 灵芝的培养

1．2．1 人工栽培

1．2．2 液态发酵培养

1．3 灵芝多糖

1．3．1 灵芝多糖的提取、分离和纯化

1．3．2 灵芝多糖的结构分析

1．3．3 灵芝多糖的药理作用

1．4 氧化与抗氧化

1．4．1 自由基与氧化

1．4．2 人体氧化的伤害

1．4．3 抗氧化

1．5 本课题研究依据及主要研究内容

1．5．1 立题依据

1．5．2 研究内容

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 菌种和子实体

2．1．2 主要药品

2．1．3 主要仪器

2．1．4 培养基

2．2 灵芝菌株培养方法

2．2．1 菌种活化

2．2．2 种子培养及种子液生长曲线测定

2．2．3 摇瓶发酵培养

2．2．4 5 L发酵罐培养

2．3 参数测定方法

2．3．1 菌丝体干重的测定

2．3．2 发酵液中葡萄糖残留量的测定

2．3．3 灵芝多糖含量的测定

2．3．4 多糖样品中蛋白含量测定

2．4 灵芝多糖的提取方法

2．4．1 发酵液粗多糖的提取

2．4．2 子实体粗多糖的提取

2．5 发酵培养条件对GLEP产量影响的研究

2．5．1 单因素实验设计

2．5．2 部分因子实验设计(FFD)

2．5．3 最陡爬坡试验

2．5．4 中心组合设计(CCD)

2．6 灵芝多糖样品的分离纯化及结构测定

2．6．1 DEAE-650离子交换柱层析纯化

2．6．2 葡聚糖凝胶G-100柱层析纯化

2．6．3 纯化多糖样品基本理化性质的测定

2．6．4 纯化多糖样品的纯度鉴定

2．6．5 紫外光谱扫描

2．6．6 红外光谱扫描

2．6．7 纯化多糖样品的单糖组成分析

2．6．8 纯化多糖样品的分子量测定

2．7 灵芝粗多糖样品体外抗氧化活性测定方法

2．7．1 DPPH自由基清除能力测定

2．7．2 羟基自由基清除能力测定

2．7．3 还原能力测定

2．7．4 酵母细胞氧化损伤模型

2．8 灵芝粗多糖样品抗疲劳活性测定方法

2．8．1 急毒实验

2．8．2 抗疲劳负重游泳

2．8．3 生理生化指标检测

2．9 统计分析

3 结果与讨论

3．1 灵芝菌体发酵培养

3．1．1 灵芝菌体基本生长情况

3．1．2 发酵培养条件对GLEP产量的影响

3．2 多糖样品的分离纯化及结构测定

3．2．1 DEAE-650离子交换柱层析纯化

3．2．2 葡聚糖凝胶G-100柱层析纯化

3．2．3 多糖样品中蛋白含量测定

3．2．4 纯化多糖样品基本理化性质的测定

3．2．5 纯化多糖样品的纯度鉴定

3．2．6 紫外光谱扫描

3．2．7 红外光谱扫描

3．2．8 纯化多糖样品的单糖组成分析

3．2．9 纯化多糖样品的分子量测定

3．3 粗多糖样品体外抗氧化活性测定

3．3．1 DPPH自由基清除能力测定

3．3．2 羟基自由基清除能力测定

3．3．3 还原能力测定

3．3．4 酵母细胞氧化损伤保护作用

3．4 粗多糖样品抗疲劳活性测定

3．4．1 急毒试验

3．4．2 抗疲劳负重游泳

3．4．3 生理生化指标检测

4 结论

5 展望

参考文献

7 攻读硕士学位期间发表论文情况

致谢