几丁质酶产生菌的筛选鉴定及几丁质裂解酶基因的克隆与表达

摘要

几丁质(chitin)是由N-乙酰氨基葡萄糖以β-1，4-糖苷键聚合而成的直链大分子，是大多数真菌细胞壁的组成成分，也广泛存在于甲壳类动物和昆虫的外壳以及昆虫的中肠围食膜中。几丁质酶作为几丁质这一主要生物多聚物的降解酶类，以其兼具抑制病原真菌生长和杀灭害虫的双重作用，且对动植物、人体无害，不污染环境的优势，而在植物病虫害无公害防治方面极有研究和利用价值，本文针对几丁质酶产生菌的筛选、抗病测试、分类鉴定、基因克隆表达等方面进行了研究，结果如下。 1.几丁质酶产生菌的分离筛选。利用平板稀释分离法从土壤中分离到132株细菌和放线菌，用平板透明圈法筛选到32株产几丁质酶菌株，其中细菌20株，放线菌12株。几丁质酶活性较强的有编号为P6、C-10、9、F2、J4、J7、4-2、X菌株。活性最强的为F2菌株，其透明圈与菌落直径比为3.14。对水稻纹枯病菌拮抗作用最强的细菌是C-10菌株，放线菌是P6菌株，抑菌带分别为7mm和12mm。通过几丁质酶活性和抑菌活性强弱确定优势拮抗菌株为P6、C-10和F2菌株。经形态特征、培养特征、细胞壁化学组分分析和生理生化分析，P6、C-10和F2菌株分别鉴定为球孢链霉菌(Streptomycesglobisporus)，短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)，浅黄金杆菌(Aureobacteriumflavesnes)。这3个菌株均为新的几丁质裂解菌。 2.菌株对病原菌的拮抗试验。以稻瘟病菌Magnaporthegrisea，水稻纹枯病菌Rhizoctoniasolani头孢霉Cephalosporiumsp.，小麦赤霉病菌Gibberellazeae，黄瓜枯萎病菌Fusariumoxysporumf.sp.cucumerinum，禾谷类镰刀菌Fusariumgraminearum，西瓜枯萎病菌Fusariumoxysporumf.sp.niveum，茄子枯萎病菌Fusariumoxysporumf.sp.Melongenae，辣椒炭疽病菌Colletotrichumgloeosporioides，马尾菇枯萎病菌Fusariumoxysporumf.sp.Coprinuscomatus，长蠕孢霉Helminthosporinm.sp11种病原真菌为指示菌，应用平皿拮抗法测定P6、F2、C-10菌株抑菌作用，显示这3个菌株对大多数病原真菌具不同程度的抑制作用，其中P6菌株对水稻纹枯病菌Rhizoctoniasolani和辣椒炭疽病菌Colletotrichumgloeosporioides的抑制作用最强，抑菌带均为12mm；C-10菌株对长蠕孢霉Helminthosporinm.sp的抑菌带为10mm。 3.几丁质酶蛋白对病原菌的拮抗试验。以辣椒炭疽病菌、水稻纹枯病菌、稻瘟病菌和黄瓜枯萎病菌4种病原真菌为病原指示菌，提取菌株P6、F2、C-10的粗蛋白做平皿抑菌测试，显示P6、F2、C-10菌株粗蛋白对4种病原真菌均具拮抗活性，其中P6菌株对水稻纹枯病菌、辣椒炭疽病菌2种病原菌的拮抗活性较强，抑菌带分别为7mm和6mm。 4.几丁质酶基因克隆研究。通过建立DNA文库的方法对C-10菌株进行了几丁质酶基因克隆研究。提取C-10菌株DNA，经Sau3AI部分酶切后分离2-10kb的片段，插入PUC19的BamHI位点，转化大肠杆菌(E.coliDH5a)，在几丁质平板上筛选阳性克隆。从菌株C-10的重组子中筛选到一个产透明圈的阳性克隆(命名为DHu)，提取其质粒(质粒命名为PUC-U)酶切鉴定，发现该克隆插入片段大约2k，对该片段进行测序，结果表明该片段长为1637bp，该序列命名为D1637。另外对P6和F2菌株也进行了几丁质酶基因克隆研究，从两个菌株的大约5400个重组子中没筛选到能产生水解圈的阳性克隆，估计是重组子数量不够。 5.生物信息学研究。对D1637序列通过softberry分析结果表明，该序列预测一个基因，其CDS长为1176bp，编码391个aa，将这一基因命名为ChiMC基因。利用DNAstar和predictprotein对蛋白质进行分析，预测其一级序列包括33个碱性aa，45个酸性，156个疏水aa，92个极性aa。利用softberry对氨基酸序列进行分析，预测蛋白质二级结构包含17个a螺旋，10个β折叠。通过Swiss预测蛋白质三维结构，结果显示该蛋白含有三个明显结构域，中央结构域包含一个锌原子。 Ncbi-Blastn序列比对显示有1216bp的一段区域与来自E.coli菌株的一段基因组DNA同源，其中与EscherichiacoliK-12MG1655菌株的基因组DNA同源性最高，达100％。该菌株的这段序列为编码磷酸甘露糖异构酶(phosphomannoseisomerase,PMI)的manAgene的编码区。另一段350bp的序列与Cestrumyellowleafcurlingvirus(CmYLCV)的基因组DNA同源，同源性高达100％，该文献对这段序列未做注释。在以上2段区域之间以及D1637序列的一端分别有56bp和17bp的空白区域，在GeneBank里找不到同源序列。说明C-10菌株基因组DNA的这段序列尚未在GeneBank里登录。通过softberry对D1637序列进行启动子预测，结果显示在CmYLCV序列区域内预测一个启动子。利用Expasy软件对蛋白质进行预测，结果显示该蛋白质含有5个功能位点：N端酰基化位点(N-myristoylationsite)、PKC磷酸化位点(ProteinkinaseCphosphorylattonsite)、酪蛋白激酶-Ⅱ磷酸化位点(CaseinkinaseⅡphosphorylationsit)、酪氨酸硫酸化位点(Tyrosinesulfationsite)、微生物羧基端定位信号位点(MicrobodiesC-terminaltargetingsignal)。通过Ncbi-Blastp、Smart、InterProScan3个蛋白质预测软件对该蛋白进行预测，结果显示该蛋白具有一个保守PMItypeI域，PMI具有催化6-磷酸甘露糖和6-磷酸果糖间异构互换的功能。 6.PET-ChiMC原核表达载体的构建与转化表达。将ChiMC基因的CDS区插入PET-30a(+)表达载体，构建了PET-ChiMC原核表达载体，转化大肠杆菌BL21，经IPTG诱导培养1～3h后，SDS-PAGE显示表达了大量目的蛋白。将表达产物点到几丁质平板上，培养3d后未出现透明圈，据此初步认为PMI本身不能降解几丁质。本试验中克隆到的基因不同于一般的几丁质酶基因，结构上与大多数几丁质酶基因没有同源性，可能是一种独特的几丁质酶基因。 7.基因功能验证。将重组大肠杆菌DHu做平板抑菌试验，结果表明DHu菌株对小麦赤霉病病原菌有明显抑制作用。其发酵液做室内杀虫试验结果显示，能显著提高Bt工程菌DHF10对菜青虫的的杀虫效率，使害虫集中死亡时间提前大约30h，而菌株DHu发酵液单独对害虫无杀灭效果。 8.几丁质酶蛋白的活性检测。用几丁质诱导发酵P6、F2、C-10以及DHu菌株，发酵液应用硫酸铵沉淀法提取粗蛋白，充分透析后在几丁质平板上呈现明显透明圈，未经几丁质诱导的P6、F2、C-10菌株对照处理不表现水解圈，而工程菌株DHu不经几丁质诱导也产生明显透明圈。

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