产纤溶酶乳酸菌的筛选及酶学性质研究

摘要

血栓栓塞类疾病的发病率近年来不断上升。利用纤溶酶溶解是血栓栓塞类疾病治疗的重要方法，而微生物是非常重要的纤溶酶来源，且具有种类多、易于培养、繁殖快，人们的提取工艺也较为成熟的优点。乳酸菌广泛存在于发酵食品中，并且大多数乳酸菌是肠道内的有益微生物。因此，从传统发酵食品中筛选产纤溶酶的乳酸菌，并对其产生的纤溶酶进行研究，对开发预防血栓栓塞类疾病的保健食品具有重要的意义。
　　本研究从传统发酵食品中分离筛选产溶纤酶的乳酸菌，对其进行形态特征、生理生化特征、16S rDNA基因序列综合鉴定，以确定菌株的种属;对目的菌株进行安全性的初步评估，选取安全的菌株进行后续研究。进行菌株的基本生物学特性的研究;对菌株所产的纤溶酶进行分离纯化，并对酶学性质进行研究;采用响应面的方法对该菌株进行产酶条件优化。主要研究结果如下:
　　(1)从传统发酵食品中经初筛、纤维蛋白平板复筛，筛选出2株溶解纤维蛋白的菌株，分别命名为HYD09和HYN06。测定两株菌的发酵上清液酶活，其分别是115.3U/mL和107.2U/mL。根据菌株菌体特征、菌落特征、生理生化特征和16S rDNA序列比对结果，判定两株菌均为粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)。
　　(2)进行安全性评估实验结果表明:菌株HYD09和HYN06溶血试验、吲哚试验、硝酸盐还原酶试验、氨基脱羧酶试验的结果均呈阴性;12种抗生素作用后，并未表现出多重耐药性;菌株HYD09无毒力基因检出，而菌株HYN06检出esp毒力基因。综合以上结果，初步推测菌株HYD09安全。因此，后续试验以菌株HYD09作为实验对象。生物学特性实验结果表明，菌株HYD09具有一定的耐酸性，且对胆盐的耐受力较好。其发酵上清液经过胃蛋白酶和胰蛋白酶处理后，仍具有纤溶活性且酶活无明显变化。
　　(3)将菌株HYD09的发酵上清液进行不同硫酸铵饱和度的分级沉淀试验，选取60％为最佳硫酸铵饱和度对菌株HYD09发酵上清液进行盐析。盐析后，透析除盐，经过DEAE-Sephadex A-25交换层析等手段处理得到两个蛋白峰，将两个峰的收集液经过浓缩，采用纤维蛋白平板检测得出峰Ⅱ具有纤溶活性，峰Ⅱ经过活性电泳和SDS-PAGE电泳均显示为一个条带，分子量为31.018kDa。整个纯化过程纤溶酶的比活力从203.2U/mg提高至1889.8U/mg，纯化倍数为9.3，回收率为19.3％。
　　(4)对纤溶酶HYD09酶学性质进行研究，结果表明:最适反应温度为35℃，最适pH值为7.5;抑制剂PMSF、IAM、β-巯基乙醇对该酶的抑制作用相对较弱，抑制率分别为2.3％、3.7％、5.8％;而EDTA则可以完全抑制该酶的活性，表明该酶可能为金属蛋白酶。金属离子对酶活的影响试验表明，Ca2+对纤溶酶HYD09的酶活力有明显的促进作用，酶活提高了12.2％，Fe2+和Ba2+对该酶的酶活力有轻微的促进作用，酶活分别提高了3％和1.8％，Zn2+对此酶有明显的抑制作用，酶活降低了86.8％。
　　(5)主要采用单因素实验法确定对菌株HYD09产酶活力影响较大的因素，选用响应面法对菌株HYD09的发酵条件进行优化，最后确定出产酶量最大的发酵条件为:乳糖9g/L，酵母提取物15g/L，接种量为2.96％，初始pH值为7.0，此条件下，产酶量可达394.74U/mL，酶活提高了3.4倍。
　　本研究筛选出两株产纤溶酶的粪肠球菌(Enterococcus faecalis)HYD09和HYN06，对菌株进行了安全性评估，初步判定菌株HYD09为安全。进一步研究菌株HYD09的生物学特性，并对其发酵条件进行优化。对纤溶酶HYD09进行分离纯化，并进行酶学性质的初步研究。从而为进一步开发和利用该酶提供科学的理论依据。

目录

声明

摘要

主要英汉及缩略词对照

1前言

1．1食品中微生物源纤溶酶的简介

1．2纤溶酶的活性测定方法

1．3食品中微生物源纤溶酶菌种筛选研究进展

1．4食品中微生物源纤溶酶酶学性质研究进展

1．4．1纳豆激酶(NK)酶学性质

1．4．2豆豉纤溶酶酶学性质

1．4．3其他食源性纤溶酶酶学性质

1．5研究目的和意义

1．6研究内容和技术路线

1．6．1研究内容

1．6．2技术路线

2材料与方法

2．1实验材料

2．1．1 样品

2．1．2菌株

2．1．3培养基与主要试剂

2．1．4主要仪器与设备

2．2实验方法

2．2．1产纤溶酶乳酸菌的筛选及鉴定

2．2．2产纤溶酶乳酸菌的安全性评估

2．2．3菌株生物学性质研究

2．2．4纤溶酶的纯化

2．2．5纤溶酶酶学性质的研究

2．2．6菌株产酶条件优化

2．3数据处理

3结果与分析

3．1产纤溶酶乳酸菌的分离

3．1．1产纤溶酶乳酸菌的筛选

3．1．2纤溶活性的测定

3．1．3产纤溶酶乳酸菌的鉴定

3．2产纤溶酶乳酸菌的安全性评估

3．2．1溶血试验

3．2．2耐药性试验

3．2．3有毒代谢产物检测试验

3．2．4毒力基因PCR检测

3．3菌株HYD09生物学特性的研究

3．3．1 菌株HYD09生长曲线的测定

3．3．2菌株HYD09酸耐受试验

3．3．3菌株HYD09胆盐耐受试验

3．3．4 胃肠道主要蛋白酶处理对酶活的影响

3．4菌株HYD09纤溶酶的分离纯化

3．4．1菌株HYD09纤溶酶的盐析

3．4．2 DEAE-Sephadex A-25离子交换层析

3．4．3纤溶酶HYD09纯化效果评价

3．5纤溶酶HYD09酶学性质

3．5．1纤溶酶HYD09最适反应温度的测定

3．5．2纤溶酶HYD09最适pH的测定

3．5．3纤溶酶HYD09不同抑制剂对纤溶活性的抑制作用

3．5．4纤溶酶HYD09不同金属离子对酶活性影响测定

3．6菌株产酶条件优化

3．6．2不同碳源对菌株HYD09产酶的影响

3．6．3不同氮源对菌株HYD09产酶的影响

3．6．4不同接种量对菌株HYD09产酶的影响

3．6．5不同装液量对菌株HYD09产酶的影响

3．6．6不同初始pH值对菌株HYD09产酶的影响

3．6．7不同培养温度对菌株HYD09产酶的影响

3．6．8响应面优化结果

4讨论

4．1产纤溶酶乳酸菌的筛选

4．2菌株HYD09安全性评估及生物学特性的研究

4．3纤溶酶HYD09酶学性质研究

4．4菌株HYD09发酵条件优化

5结论与展望

5．1结论

5．2创新点

5．3展望

参考文献

致谢

作者简历