产纤溶酶海洋微生物的筛选鉴定、发酵产酶、酶的纯化及酶学性质研究

摘要

研制高效、安全、价格低廉的溶血栓药物一直是医药界研究的热门。微生物作为溶栓药物的一个新来源，其所产纤溶酶具有分子量小，容易吸收利用，使用安全等特点，非常具有开发价值。本文从菌种的筛选开始，主要完成了以下研究内容。
　　 通过平板初筛、摇瓶复筛，从采自广西北海的海泥中筛选出一株高纤溶酶活力的菌株HQS-3。对该菌株进行形态、生理生化鉴定及16S rDNA序列分析，结果表明该菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。该菌株产纤溶酶初始酶活高达1980U/mL，遗传稳定，纯化后的纤溶酶并未发现有溶血现象。
　　 对菌株HQS-3的产酶条件进行研究，菌株HQS-3最佳培养基组成为(w/v)：可溶性淀粉5％，大豆蛋白胨1.5％，CaCl20.02％，KH2PO40.1％，K2HPO40.3％，MgSO47H2O0.35％;最佳发酵条件为：发酵温度31℃，初始发酵pH为7.5，转速180r/min，接种量4％，种子培养时间18h，装液量50mL/250mL三角瓶，发酵时间66h。在此条件下，菌株HQS-3的纤溶酶活力由1980U/mL提高到4380U/mL，提高了1.2倍。
　　 菌株发酵粗酶液经过硫酸铵沉淀、碱溶液处理、膜分离、离子交换层析和凝胶过滤层析后，得到电泳纯的纤溶酶，分子量约为28KDa，酶活回收率为13％，比酶活达到62745U/mg。
　　 酶学性质研究显示菌株HQS-3所产纤溶酶的最适酶促反应pH为8.0，在pH6.0～11.0间稳定；最适反应温度在45℃到50℃之间，在低于35℃的范围内有较好的稳定性，但是温度高于45℃以后迅速失活。蛋白酶抑制剂PMSF和EDTA对该纤溶酶都有明显的抑制作用，表明该纤溶酶为一种丝氨酸蛋白酶，其活性中心依赖于金属离子。Ca2+、Mg2+均对酶活力有促进作用；Fe3+、Cu2+、Zn2+对酶活力有着明显的抑制作用；低浓度的Mn2+对纤溶酶的酶活力有一定的促进作用，而高浓度的Mn2+对酶的活力有微弱的抑制作用。初步判断该纤溶酶等电点在9.0至9.2之间。利用加热的纤维蛋白平板与未加热的纤维蛋白平板测酶活对比，发现菌株HQS-3产纤溶酶不是激酶，它直接作用于纤维蛋白并将其分解。SDS-PAGE凝胶电泳分析表明该纤溶酶作用于纤维蛋白时最先迅速分解纤维蛋白的α链，对β链的分解速度要慢于α链，而纤溶酶分解γ-γ链的速度最慢。