P-选择素不同功能域克隆、单抗制备及其功能的初步研究

摘要

P-选择素（P-selectin）是细胞粘附分子选择素家族的主要成分,是急性炎症早期介导炎症细胞向受损部位趋集过程中的重要因素.进一步阐明P-selectin结构与功能及其在肾脏疾病等病理机制中的作用,并为针对其的临床特异性抗粘附治疗奠定基础.为此我们设计并进行了以下的研究.利用PT-PCR技术,该研究首先从人外周血血小板中克隆出P-selectincDNA,并扩增和获得了其中Lectin片段及Lectin-EGF片段,然后将目的基因分别插入含有Kan的质粒pET42b（+）中和含有Amp的质粒pcDNA4/HisMaxA中.再将含有目的基因的重组质粒转化入DH5α中进行大量扩增并鉴定.经测序发现,所获目的基因序列与相关文献和GeneBank（登录号M25322）序列完全一致.将含有目的基因的重组质粒分别在真核表达系统CHO和原核表达系统BL21中进行表达,利用限制性酶切、测序以及蛋白印迹检测发现目的基因均能表达.但在真核表达系统中的表达水平偏低.选择了原核表达系统BL21.将一定量表达的目的蛋白通过Ni-NTA柱进行纯化,得到mg级纯化的蛋白,通过SDS-PAGE电泳、ELISA、WesternBlot方法证明所获蛋白即为目的蛋白.利用杂交瘤技术先行制备了抗人P-selectinLectin-EGF单克隆抗体.并通过ELISA方法,证实所获单克隆抗体能与P-selectin抗原、及其Lectin、Lectin-EGF片段特异性反应;通过间接细胞免疫荧光染色和流式细胞仪检测.两个试验均证实了该研究所制备的单克隆抗体的特异性.进一步通过细胞粘附试验,证明所获单克隆抗体具有阻断经凝血酶刺激活化的血小板与嗜中性粒细胞结合的活性.

目录

第一部分人P-选择素Lectin、Lectin-EGF片段基因克隆及表达

引言

材料与方法

结果

讨论

第二部分抗人P-选择素Lectin-EGF片段单克隆抗体的制备及一般性质

引言

材料与方法

结果

讨论

第三部分抗人P-选择素Lectin-EGF片段单克隆抗体特异性及功能鉴定

引言

第一节单克隆抗体特异性检测

材料与方法

结果

第二节单克隆抗体功能检测

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

综述

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