中国被毛孢甾醇提取最优条件的正交法研究

摘要

冬虫夏草[Cordyceps sinensis(Berk.)Sacc.]是传统名贵中药,具有保护呼吸系统、维护肾功能、抗癌、抗氧化等作用。其无性型为中国被毛孢(Hirsutellasinensis Liu,Guo,Yu& Zeng),具有广阔应用前景。甾醇类物质是冬虫夏草主要活性成分之一,其中麦角甾醇是真菌特征甾醇,具有显著的抗癌活性,本课题主要对中国被毛孢甾醇提取的最优条件进行研究。
　　 对磷硫铁法和香草醛-冰醋酸比色法测定总甾醇含量进行了方法学研究,2种方法显色1小时后吸光值变化幅度均小于1％,稳定性较好；精密度RSD分别为1.9％和3.6％；回收率分别为126.3±16.5％和105.4±3.6％,香草醛-冰醋酸法准确度更高；选择香草醛-冰醋酸法为中国被毛孢总甾醇含量的测定方法。单因素实验考查皂化用碱量、乙醇浓度、提取时间、料液比、提取次数5个因素对超声波辅助提取总甾醇的影响,发现皂化用碱量、乙醇浓度、提取次数三因素相邻水平差异显著(P<0.05),而提取时间、料液比(除1／100外)对提取影响均无统计学显著性(P>0.05)；再以KOH／菌丝体比值分别为0、0.5、1,乙醇浓度分别为60％、80％、95％,提取次数分别为1、2、3的3因素3水平正交法优化超声波辅助提取条件,得最佳提取条件为:KOH／菌丝体比值为1,乙醇浓度为95％,提取3次,并测得总甾醇含量约为5.016％±0.205％。单因素试验显示温度对热回流提取效果影响很小；以与超声波法相同的3因素3水平正交设计对热回流法进行考察,得最佳提取条件为:回流温度50℃,KOH／菌丝体比值为0.5,乙醇浓度为95％,提取2次,每次1小时。验证试验显示,超声波法优于热回流法。建立了RP-HPLC测定中国被毛孢总麦角甾醇含量的方法,以Hypersil C18反向色谱柱(250min×4.6mm,5μm),纯甲醇流动相,上样量20μL,流速1.0mL／min,检测波长282nm,测得总麦角甾醇含量为0.08％。

目录

文摘

英文文摘

第一章 冬虫夏草的成分和药理作用

1.1 冬虫夏草介绍

1.1.1 冬虫夏草的无性型的确定

1.1.2 冬虫夏草的甾醇类物质

1.2 冬虫夏草的药理作用

1.2.1 肾功能维护作用

1.2.2 保护呼吸系统、调节心血管系统的功能

1.2.3 机体免疫调节功能

1.2.4 抗肿瘤

1.2.5 抗氧化、清除体内自由基作用

1.2.6 神经系统调节作用

1.2.7 抗菌抗病毒作用

1.2.8 保护肝脏的作用

1.2.9 其他作用

1.3 课题的提出、目的和内容

1.3.1 课题的提出

1.3.2 课题的目的

1.3.3 课题的设计、研究内容

第二章 材料和方法

2.1 磷硫铁法测定中国被毛孢总甾醇含量方法学研究

2.1.1 材料和仪器

2.1.2 试剂和溶剂配制

2.1.3 样品制备

2.1.4 实验方法

2.2 香草醛-冰醋酸法测定中国被毛孢总甾醇含量方法学研究

2.2.1 材料和仪器

2.2.2 试剂和溶剂配制

2.2.3 样品制备

2.2.4 实验方法

2.3 超声波辅助提取中国被毛孢总甾醇

2.3.1 材料和仪器

2.3.2 试剂和溶剂配制

2.3.3 实验方法

2.4 热回流法提取中国被毛孢总甾醇

2.4.1 材料和仪器

2.4.2 试剂和溶剂配制

2.4.3 实验方法

2.5 RP-HPLC测定中国被毛孢麦角甾醇含量

2.5.1 材料和仪器

2.5.2 试剂和溶剂配制

2.5.3 样品制备

2.5.4 实验方法

第三章 :中国被毛孢总甾醇含量测定和提取方法研究

3.1 磷硫铁法测定中国被毛孢总甾醇含量方法学研究

3.1.1 吸收波长的确定

3.1.2 标准曲线的建立

3.1.3 稳定性实验结果

3.1.4 精密度实验结果

3.1.5 回收率实验结果

3.1.6 分析与讨论

3.2 香草醛-冰醋酸法测定中国被毛孢总甾醇含量方法学研究

3.2.1 吸收波长的确定:

3.2.2 标准曲线的建立

3.2.3 稳定性试验

3.2.4 精密度试验

3.2.5 回收率试验

3.2.6 分析与讨论

3.3 正交优化超声波辅助提取中国被毛孢总甾醇方法

3.3.1 单因素分析皂化用碱量的影响

3.3.2 单因素实验分析料液比影响

3.3.3 单因素实验分析提取时间影响

3.3.4 单因素实验分析乙醇浓度影响

3.3.5 单因素实验分析提取次数的影响

3.3.6 正交试验结果

3.3.7 验证试验

3.3.8 分析与讨论

3.4 正交优化热回流提取中国被毛孢总甾醇方法

3.4.1 单因素分析热回流温度的影响

3.4.2 正交试验结果

3.4.3 验证试验

3.4.4 分析与讨论

3.5 小结

第四章 RP-HPLC测定中国被毛孢麦角甾醇含量

4.1 Hypersil BDS C18(210mm×4.6mm,5m)色谱柱结果

4.1.1 100％甲醇流动相等度洗脱结果

4.1.2 90％甲醇流动相等度洗脱结果

4.1.3 乙腈/甲醇(75/25,V/V)流动相等度洗脱结果

4.1.4 A甲醇/水(80/20,V/V),B甲醇/二氯甲烷(75/25,V/V)梯度洗脱结果

4.2 Hypersil C18色谱柱(250 mm×4.6mm,5 m)

4.2.1 纯甲醇流动相色谱图

4.2.2 标准曲线绘制

4.2.3 中国被毛孢麦角甾醇含量测定

4.2.4 讨论

4.3 小结

总结

致谢

参考文献

攻读硕士期间的研究成果