碳源对干酪乳杆菌LC2W胞外多糖的生物合成及免疫活性的影响

摘要

近年来，乳酸菌胞外多糖受到越来越多的关注，除了可以改善产品的质地如口感和粘稠度外，它还有很好的生理活性，如：抗肿瘤、免疫调节等。本文对干酪乳杆菌LC2W胞外多糖的生物合成、分离纯化、结构和免疫活性等进行了系统研究。 以MRS为基础培养基，对影响干酪乳杆菌LC2W产胞外多糖的主要营养因子：葡萄糖、酪蛋白胨和酵母提取物进行了单因素及正交试验，确定培养基组成为葡萄糖60.0g/L，酪蛋白胨16.0g/L，酵母提取物10.0 g/L，牛肉膏粉8.0g/L，磷酸氢二钾2.0g/L，吐温-80 1.0ml/L，柠檬酸氢二铵2.0g/L，乙酸钠5.0g/L，硫酸镁0.2g/L，硫酸锰0.04g/L。 采用响应面分析法(RSM)对影响干酪乳杆菌LC2W合成胞外多糖的培养条件进行了优化。确定的最适培养条件为：接种量4％，发酵温度31.5℃，发酵时间32h。验证试验结果表明，在此条件下胞外多糖的产量可达157.46 mg/L。此外研究还发现控制pH 6.0左右发酵，EPS的产量可达371.90mg/L，是未控制pH时产量的2.36倍。 对影响干酪乳杆菌LC2W胞外多糖提取的主要工艺参数进行了研究。单因素和正交试验结果表明，用截留分子量为10KD的超滤膜将发酵上清液浓缩4倍后，用终浓度为6％的三氯乙酸脱蛋白，再用5倍体积95％乙醇4℃沉淀24h，多糖提取效果较佳。在此条件下，蛋白脱除率可达88.35％，EPS提取率可达92.17％。 分别以葡萄糖、乳糖为碳源合成的粗多糖经过DEAE Sepharose Fast Flow离子交换柱分级纯化均得到三个组分：G1、G2、G3和L1、L2、L3。分别为粗多糖质量的21.33％、33.53％、29.67％和36.73％、18.51％、21.67％，总回收率为84.53％和76.9l％。G1、G2和L1、L2为中性多糖，在Sepharose CL-6B和HPLC上都显示均一组分。 运用紫外光谱、红外光谱、HPLC和气相色谱对两种碳源获得的单一组分G1、G2和L1、L2的结构进行了初步分析。紫外光谱分析都不含蛋白和核酸；红外光谱分析Gl、G2和L1、L2均呈现多糖的特征峰，但波形、特征吸收波段、波峰强度有些差异；HPLC测定G1、G2、L1和L2的平均分子量分别为6.65×105Da、1.01×104 Da、2.25×106Da和1.36×104Da；气相色谱分析G1、G2和L1、L2的主要单糖组成摩尔比分别为：鼠李糖：葡萄糖：半乳糖=3.07:3.29:1；鼠李糖：葡萄糖：半乳糖：2.84:6.4:1；甘露糖：葡萄糖：半乳糖=17.24:6.03:1；甘露糖：葡萄糖：半乳糖=28.71:5.98:1。体外细胞培养试验结果表明，G1、G2和L1、L2均无细胞毒性，在5-80ug/ml，的浓度范围内L1对B淋巴细胞增殖的抑制作用比G1强，具有明显的剂量效应，其抑制作用与浓度呈负相关；与此相反，在5-80ug/mL的浓度范围内，G2对B淋巴细胞增殖抑制作用比L2强，表现为明显的剂量效应，其抑制作用与浓度呈正相关。 因此，碳源的改变会影响干酪乳杆菌LC2W胞外多糖的组成，并引起其生理活性产生差异。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章绪论

1.1乳酸菌胞外多糖

1.2乳酸菌胞外多糖国内外研究现状

1.2.1产胞外多糖的乳酸菌

1.2.2乳酸菌胞外多糖的分类与生物合成

1.2.3乳酸菌胞外多糖的分离纯化和结构分析

1.2.4乳酸菌胞外多糖的生理功能

1.2.5乳酸菌胞外多糖的构效关系

1.2.6影响乳酸菌胞外多糖合成的主要因素

1.2.7乳酸菌EPS的应用前景展望

1.3本研究的主要内容和重要意义

第二章干酪乳杆菌LC2WEPS生物合成条件的优化

2.1引言

2.2材料与设备

2.2.1菌种及培养方法

2.2.2试剂

2.2.3培养基

2.2.4试验仪器及设备

2.3实验方法

2.3.1胞外多糖测定方法

2.3.2胞外多糖的提取与测定

2.3.3培养基主要成分对LC2W合成EPS的影响

2.3.4培养条件对LC2W EPS合成量的影响

2.4结果与讨论

2.4.1培养基主要成分对LC2W合成EPS的影响

2.4.2培养条什对LC2W EPS合成量的影响

2.5本章小结

第三章干酪乳杆菌LC2W胞外多糖的分离纯化研究

3.1引言

3.2材料与设备

3.2.1试剂

3.2.2主要仪器

3.3实验方法

3.3.1 EPS提取纯化的工艺流程图

3.3.2蛋白质含量测定

3.3.3多糖含量测定

3.3.4干酪乳杆菌LC2W EPS的提取

3.3.5干酪乳杆菌LC2W EPS的纯化

3.3.6多糖的纯度鉴定及分子量测定

3.3.7紫外光谱(UV)分析

3.4结果与讨论

3.4.1超滤浓缩倍数的选择

3.4.2三氯乙酸终浓度的选择

3.4.3乙醇沉淀法提取胞外多糖的正交实验结果

3.4.4正交试验方差分析

3.4.5验证试验及结果

3.4.6 DEAE Sepharose Fast Flow离子交换柱分级纯化

3.4.7 Sepharose CL-6B柱层析纯化

3.4.8多糖的纯度鉴定和相对分子量分布测定

3.4.9紫外光谱分析

3.5本章小结

第四章改变碳源对干酪乳杆菌LC2W胞外多糖组成和免疫活性影响的初步研究

4.1引言

4.2材料与设备

4.2.1试剂

4.2.2主要仪器

4.3实验方法

4.3.1以乳糖为碳源发酵的EPS生物合成及提取纯化

4.3.2蛋白质含量测定

4.3.3多糖含量测定

4.3.4多糖的纯度鉴定及分子量比较

4.3.5紫外光谱(UV)分析比较

4.3.6红外光谱分析比较

4.3.7单糖组成及其摩尔比比较

4.3.8不同来源的EPS对体外免疫活性的影响

4.4结果与讨论

4.4.1以乳糖为碳源粗多糖的DEAE Sepharose Fast Flow离子交换柱分级纯化

4.4.2 Sepharose CL-6B柱层析纯化

4.4.3多糖的纯度鉴定和相对分子量分布的比较

4.4.4紫外光谱分析比较

4.4.5红外光谱分析比较

4.4.6单糖组成及其摩尔比比较

4.4.7不同来源的EPS对体外免疫活性的影响

4.5本章小结

全文主要结论

问题与展望

参考文献

致谢

攻读硕士期间发表论文清单