混合培养中致病性及非致病性副溶血性弧菌的比例变化研究

摘要

副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus,VP)是一种常见的食源性致病菌，属于革兰氏阴性菌，也是一种嗜盐菌。其常见于海洋和河口地区，通过海产品感染人体引起肠胃炎等疾病，是我国沿海地区的主要致病菌。随着世界水产品贸易的不断发展和繁荣，其在日本、美国和世界其他地区爆发引起的食品安全事故也屡见于报道，对公众健康造成了极大的威胁。同时其常见宿主包括牡蛎和南美白对虾等都有着重要的经济价值和食用价值，副溶血性弧菌引起的食品安全事件造成了不可估量的损失。目前的副溶血性弧菌检测，主要针对其总数，而致病性副溶血性弧菌的研究和检测对正确地对副溶血性弧菌进行风险评估，有着重要的意义。
　　1.本研究在菌落原位杂交中对常见食源性致病菌副溶血性弧菌的杂交条件进行了优化。基于副溶血弧菌的tdh，trh，toxR基因选用了三种探针序列，从原位杂交样品的预处理方法、杂交时间和显色检测等方面对基于副溶血弧菌毒力基因的原位杂交实验进行了条件优化。实验表明，采用80℃热固定2h，37℃预杂交10min后杂交8 h以及封闭1 h的改良方法可获得高特异性，低背景且着色清晰的实验结果。优化的菌落原位杂交技术检测副溶血性弧菌与传统检测方法相比，具有高效、准确、可区分致病性菌株的优点，为副溶血弧菌致病菌株和非致病菌株的同步检测和筛选提供了技术支撑。
　　2.本研究以9:1和1:1的比例对致病性副溶血性弧菌(ATCC33847:tdh+/trh-/tlh+; ATCC17802:tdh-/trh+/tlh+)和非致病性副溶血性弧菌(G2:tdh-/trh-/tlh+; G8:tdh-/trh-/tlh+)在TSB培养基和熟虾样品中分别进行了混合和37℃10小时的混合培养。通过菌落原位杂交技术和菌落PCR技术检测致病性菌株在混合培养前后的比例。其结果显示，在TSB和熟虾中，致病菌比例均出现了下降。在24组混合培养中，有20组出现了下降，其中18组降幅超过原比例的一半以上，17组下降的比例超过总体的40％。且致病菌株的下降趋势在熟虾样品中更为明显，当ATCC17802和G8在熟虾样品中以9:1比例混合并混合培养10小时后，完全没有检测到致病菌株的存在。因此推测，非致病性菌株和致病性菌株之间的相互作用，可能是造成食品样品中很难分离到副溶血性弧菌致病性菌株的原因之一。
　　3.本研究在通过菌落原位杂交技术和菌落PCR技术检测致病性菌株在混合培养前后的比例的基础上，检测了单一菌株与混合菌株在混合培养阶段的总菌数变化，分析了混合培养中不同时间点致病菌的比例变化趋势，比较了两个常见温度下混合培养前后致病菌比例变化的差异。结果显示，混合菌株在混合培养中的总菌数与单一菌株基本相近，而在37℃等比例的混合培养中比例的下降趋势在对数期后期开始增高，而致病菌处于优势时并未出现下降，在25℃时致病菌比例下降更为明显。由此推测致病菌在混合培养中的比例下降现象可能是由于致病性菌株在营养缺乏和温度下降等环境中的抗逆性较差，但其真实机理的确定还需要更多地相关研究。

目录

声明

英文缩写词表

第一章 文献综述

1．研究背景

2．副溶血性弧菌

3菌落原位杂交技术及其发展

4．风险评估与检测误差

第二章 菌落原位杂交法用于致病性副溶血性弧菌检测的实验条件优化

1．引言

2 材料与方法

3 结果与分析

4 讨论

5 本章小结

第三章 混合培养前后致病性副溶血性弧菌比例的检测

1．引言

2．材料与方法

3 结果与讨论

4 讨论

5 本章小结

第四章 混合培养中致病菌比例下降机理初探

1．引言

2 材料与方法

3 结果与讨论

4 本章小结

全文总结

参考文献

致谢