生物转化法生产天然手性γ-癸内酯

摘要

γ-癸内酯具有桃子的香气，存在于多种食品中，是香精香料行业广泛应用的一种香原料。过去，γ-癸内酯主要是从水果中提取或是化学合成的，随着消费者对天然产品需求的上升，研究人员开始使用生物技术制取γ-癸内酯的方法。 微生物法是生产较安全的、高生物活性的香味化合物及其复合物最有前途的方法。有许多专利和文献报道关于微生物法合成γ-癸内酯的工艺，使用如Sporidiobolusruinenii、Sporidiobolussalmonicolor、Yarrowialipolytica、Sporobolomycesodorus等菌种，均能利用蓖麻油、蓖麻油酸或蓖麻油酸甲酯生产γ-癸内酯。由于微生物法生产的γ-癸内酯大多具有旋光活性，在香料行业有特殊的用途，本研究选择了采用微生物转化法生产γ-癸内酯的路径。 本研究的工作包括： 1.对文献报道的产内酯菌株进行了筛选，得到一株较为适宜的菌株YarrowialipolyticaAs2.1405作为出发菌株，并确定了初筛培养基配方和条件，初始摇瓶平均产量为0.6g/L。 2.YarrowialipolyticaAs2.1405连续经过紫外诱变、NTG诱变、DES诱变和钴60诱变，最终筛选得到一株高产内酯菌种167＃，摇瓶平均产量为1.4g/L，遗传稳定性良好。 3.对培养基配方中的碳、氮源以及一些维生素和无机盐离子浓度进行了优化试验。经过培养基配方优化，确定了最优组合配方。其工艺条件经优选为：装液量50mL/500mL，pH6.5，培养温度28℃，摇床转速200rpm，发酵48小时，癸内酯平均产量2.04g/L。 4.研究了γ-癸内酯及其相应羟基酸—4-羟基癸酸(4-HydroxydecanoicAcid，HA)对Yarrowialypolytica菌株生长的影响，80mg/L的癸内酯就已对菌体生长产生了强烈的抑制作用，癸内酯浓度达到200mg/L以上时，菌体完全不生长，说明癸内酯对YarrowiaLypolytica菌体细胞有较强的毒性。羟基酸浓度低于200mg/L时基本不影响菌体的生长，羟基酸浓度达到400mg/L时才开始对菌体生长出现抑制。比较γ-癸内酯和4-羟基癸酸对菌体最太生长速率的影响可以看出4-羟基癸酸对Yarrowialypoiytica菌株的生长也有—定的影响，但毒性相对于γ-癸内酯要小得多。因此在发酵生产γ-癸内酯的过程中，应尽量控制产物以羟基酸的形式存在，以减小产物对细胞的抑制。 5.经过摇瓶发酵条件的优化后，利用5L和50L自控发酵罐进行放大试验。试验表明溶氧、转速以及蓖麻油的添加方式对于发酵产率有较大的影响。在适宜的溶氧和转速的条件下，在发酵初期种子生长阶段不添加蓖麻油或添加少量蓖麻油进行诱导，种子生长旺盛后再加入大量蓖麻油进行转化，癸内酯产量达到3.2g/L以上，有效提高了蓖麻油的转化率，癸内酯产量比原始出发菌种提高了5倍。 6.对发酵液后处理进行了摸索，确定了后处理工艺：发酵结束后发酵液经酸化、加热、离心、有机溶剂萃取、溶剂回收、粗馏、精馏等一系列操作最终得到γ-癸内酯产品，并确定了各操作单元的工艺参数。最终产品纯度：98.3％，旋光度[()]20D：+38.12度(理论值为+48.5度)，对映体过量率(e.e.％)：93.42％，产品质量指标达到国际水平。 由于粗馏和精馏过程温度较高，时间较长，终产品中易混有焦糊昧，因此探索了利用超临界二氧化碳萃取来替代高温减压蒸馏过程。试验结果表明超临界二氧化碳萃取和分馏过程联用，对癸内酯进行粗提，可以取得较好效果。 7.在50L自控罐的试验数据基础上进行了1吨罐的线性放大设计，完成了对年产100公斤γ-癸内酯产品的扩大初步设计，进行了生产成本核算、设备选型和设备设计。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：图目录及表目录

第一部分生物转化法生产天然手性γ-癸内酯

1绪论

1.1研究背景

1.2生物合成天然γ-癸内酯的国内外研究现状

1.3研究的意义

1.4研究内容

2产内酯菌种的筛选

2.1前言

2.2材料与方法

2.3实验内容

2.4结果与讨论

2.5本章小结

3菌种的诱变筛选

3.1前言

3.2材料与设备

3.3实验方法

3.4实验内容

3.5实验结果

3.6本章小结

4发酵工艺的优化

4.1前言

4.2材料与方法

4.3试验内容

4.4试验结果

4.5本章小结

5γ-癸内酯及4-羟基癸酸对Yarrowia lipolytica菌株生长的影响

5.1前言

5.2材料与方法

5.3实验内容

5.4实验结果

5.5本章小结

6 5 L及50 L发酵罐实验

6.1前言

6.2材料与设备

6.3实验内容

6.4实验结果

6.5本章小结

7发酵液的后处理

7.1前言

7.2试剂和设备

7.3测定方法

7.4实验内容

7.5实验结果

7.6本章小结

8结论

参考文献

第二部分年产100公斤天然丙位癸内酯扩大初步设计方案

1设计说明

2缩写符号一览表

3工艺流程简述

3.1菌种筛选概述

3.2工艺过程概述

4发酵操作单元

4.1物料恒算

4.2热量恒算

4.3循环水用量

4.4用电量

4.5发酵单元的原料和动力成本核算

5发酵液后处理单元

5.1物料恒算

5.2热量恒算

5.3循环水用量

5.4用电量

5.5发酵液后处理单元的原料和动力成本核算

6发酵液萃取和溶剂回收操作单元

6.1物料恒算

6.2热量恒算

6.3循环水用量

6.4用电量

6.5萃取和回收单元的原料和动力成本核算

7丙位癸内酯产品的粗馏操作单元

7.1物料恒算

7.2热量恒算

7.3循环水量

7.4用电量

7.5粗馏单元的原料和动力成本核算

8丙位癸内酯产品的精馏操作单元

8.1物料恒算

8.2热量恒算

8.3循环水用量

8.4用电量

8.5精馏单元的原料和动力成本核算

9 1 kg丙位癸内酯产品的成本核算

1 0本设计所需设备一览表

11所需设备型号设计

11.1计量泵

11.2精馏塔

11.3萃取塔

11.4二氯甲烷回收冷凝器

11.5粗馏用冷凝器

11.6精馏用冷凝器

11.7粗馏塔

12车间平面布置

13土建

14仪表

1 5参考文献

附件：丙位癸内酯评香报告

致谢

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