氯碘喹啉对细胞金属离子稳态的调控作用研究

摘要

矿质元素是生物体生存所必需的重要基础物质之一，构成细胞组织成分，调节生理功能发挥重要作用。然而人体内必需金属离子失衡或坏境有毒金属离子的侵入将导致多种疾病的发生，如心血管疾病、神经退行性疾病等。氯碘喹啉(Clioquinol，CQ)，最早用于治疗疟疾，但因产生一些副作用，如视网膜病变、心脏病等，被某些地区禁止使用。近来研究发现该药具有降低金属离子在中枢系统的富集，对神经退行性疾病有一定的治疗作用，重新引起了人们的重视，但其中的分子机制并不清楚。本文利用金属组的研究方法以及模式生物酵母(S.cerevisiae)研究了CQ对胞内金属离子内稳态调控的分子机制。
　　首先，通过ICP-AES方法检测了CQ对小鼠不同组织内Zn2+、Fe3+、Cu2+、K+、Mg2+和Ca2+含量的影响，数据显示Zn2+和Fe3+含量降低，而Ca2+含量升高。酵母中亦如此。其中钙离子参与神经递质的合成与释放，在细胞信号转导中也有重要生物学意义，所以深入研究了CQ对胞内钙离子的调节机制。利用pmc1△、vcx1△、pmr1△、cch1△多种钙离子转运缺陷菌株的药物敏感分析及离子检测分析，发现CQ处理，抑制细胞Zn2+、Fe3+吸收，但不同于EDTA的作用,促进了Ca2+富集，并与处理浓度成正相关性；但PMR1缺失突变后胞内钙离子含量基本不受CQ的影响，推测PMR1p可能是CQ的靶蛋白或CQ抑制了PMR1的表达。
　　其次，用RT-PCR检测和荧光显微镜观察CQ对PMR1转录和PMR1-GFP表达的影响，结果表明CQ下调了PMR1的表达。进一步探究发现CQ的抑制作用依赖于转录因子CRZ1。随后将PMR1启动子区域（-1000~0bp）上含不同转录因子结合域的三个片段分别插入荧光素酶标记基因（Ycplac33-Rluc）的起始密码子前，荧光素酶检测表明CQ对转录因子CRZ1p与PMR1启动子-918bp(b段)区域的结合起到调控作用而抑制PMR1表达；同时通过RT-PCR及CRZ1-GFP的检测也证实了CQ抑制了CRZ1p的表达水平。
　　PMR1p是内质网、高尔基体膜钙离子泵ATPase，内质网是细胞内钙离子储存的主要场所，其与内质网应激息息相关。所以，最后检测了CQ对内质网应激的作用，结果发现CQ与DTT引起内质网应激机制不同，药物通过抑制PMR1的表达进而改变内质网钙离子内稳态来调控内质网应激反应。
　　综上所述，CQ抑制了转录因子CRZ1的表达，同时抑制CRZ1p与PMR1启动子的结合，从而抑制了PMR1的转录，抑制了内质网/高尔基体对胞内钙离子的利用及外排，促进了液泡对钙离子的吸收，导致胞内钙离子升高。

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缩略语

1.绪论

1.1喹啉及衍生物研究背景

1.2金属组学在疾病研究中的应用

1.3课题研究意义与内容

2.氯碘喹啉对小鼠不同组织内金属离子含量的影响

2.1 材料与试剂

2.2 实验仪器

2.3 试验方法

2.4结果与分析

3.氯碘喹啉对酿酒酵母胞内阳离子稳态的影响

3.1 CQ显著抑制酵母菌株的生长

3.2 CQ影响了细胞内阳离子水平

3.3 野生型和离子转运缺陷菌株的CQ敏感表型分析

3.4阳离子的添加对酵母菌株CQ敏感表型的影响

3.5离子转运缺陷菌株的离子检测

3.6小结与讨论

4.CQ影响酵母细胞内钙离子含量的分子机制

4.1 CQ对PMR1 mRNA 表达量的影响

4.2 CQ对PMR1转录因子缺失突变体PMR1 mRNA的表达量的影响

4.3 CQ对CRZ1 mRNA 表达量的影响

4.4构建YCplace33-RLUC载体

4.5 YCplace33-Rlu-启动子基因的构建

4.6荧光素酶表达量的检测

4.7所得结论进一步验证

4.8 小结与讨论

5.CQ对酵母细胞内质网UPR效应的影响

5.1 材料与试剂

5.2 仪器

5.3 试验方法

5.4 结果与分析

6. 结论

参考文献

攻读学位期间的研究成果

致谢