基于核酸等温扩增技术的克柔念珠菌早期分子诊断技术

摘要

念珠菌属真菌是最常见的机会性致病菌，临床上常见的致病菌主要有白念珠菌（C.albicans）、近平滑念珠菌（C.parapsilosis、热带念珠菌（C.tropcalis）、光滑念珠菌(C.glabrata)以及克柔念珠菌(C.krusei)等五种，占人类病原真菌感染的95％。其中白念珠菌引起的感染最为常见，但是近年来越来越多的文献报道由非白念珠菌引起的感染正逐年增多。克柔念珠菌作为临床五大常见念珠菌之一，其感染多见于患有血液系统肿瘤等免疫力低下的患者，可引起粘膜感染、真菌血症以及其它实质器官的感染。临床上应用氟康唑预防真菌感染、近年来器官移植的开展以及广谱抗生素等的使用，均使得克柔念珠菌的发病率逐年上升，引起的死亡率居高不下。
　　目前临床上常用的病原真菌的诊断方法主要有镜检、培养以及病理等形态学上的观察，API20C等生化代谢鉴定方法，血清学抗原检测等免疫学方法，目前临床上仍以镜检培养以及组织病理结果作为诊断感染的金标准，但是培养所需要的周期长、镜检和病理学检查对检验人员要求较高，存在较高的假阳性和假阴性。血清学方法也有待改进，容易出现误诊和漏诊，延误患者病情，在临床应用上有一定的局限性。因此临床上急需一种早期快速、特异的方法来诊断病原真菌感染。
　　随着分子生物学理论和技术的不断发展，目前基于核酸和蛋白质的分子诊断技术已经开始逐步应用于临床，分子水平的诊断技术需要的时间短、特异性和敏感性高，在一定程度上克服了传统诊断方法的缺陷，可以实现对病原菌的早期、特异诊断，改善患者预后、提高患者生存率。核酸等温扩增技术能在一定温度下完成对DNA或RNA的扩增，与传统PCR方法相比，核酸等温扩增技术对仪器的要求极大地简化，恒温水浴即可完成反应，时间也大大地缩短，能满足实现操作简单、快速诊断的需求。环介导等温扩增技术针对基因序列的六个独立片段设计两对引物，实现对核酸片段的特异性扩增。自从2000年Notomi等报道这一技术以来，目前环介导等温扩增技术已经被研究用来结核杆菌、大肠埃希杆菌、组织胞浆菌、流感病毒、沙门氏菌等多种病原微生物的诊断。
　　Jacobsen MD等利用多位点序列分型(Multilocus sequence typing，MLST)的方法找到克柔念珠菌的6个管家基因即ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、NMT1、TRP1来对克柔念珠菌分型，这些片段都富含单核苷酸多态性位点(Single nucleotidepolymorphism，SNPs)，可以用来区分不同的致病菌种，有很强的特异性。本研究根据这6个基因片段的大小以及扩增子的长度，选择ADE2基因位点作为此次实验的靶基因片段，收集标准菌株和模式菌株共47株菌，其中包括克柔念珠菌（Candidakrusei）13株、克柔念珠菌有性型-东方伊萨酵母（Issatchenkia orientalis）也被称为库德里阿兹威（氏）毕赤酵母(Pichia kudriavzevii)2株，以及在进化上和克柔念珠菌最近的9种菌株、临床常见酵母致病菌15株，临床常见丝状菌8株作为阴性对照菌株。提取相关菌株DNA后，分别采用两种核酸扩增方法即环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)技术和实时定量荧光PCR(Real-time quantitative，qPCR)，技术对所得到的DNA进行扩增和检测，并比较两种方法在诊断的敏感性和特异性上的差异。
　　本研究分别设计了针对克柔念珠菌ADE2基因序列的LAMP技术和实时定量荧光PCR技术的引物，实现了对克柔念珠菌的早期、快速、特异扩增。经过敏感性和特异性的验证，LAMP技术和qPCR技术在对克柔念珠菌的诊断上特异性可以达到100％;在敏感性上，LAMP技术可以达到5×103拷贝/μL，qPCR技术可以达到5×104拷贝/μL。本研究在一定程度上为临床早期诊断克柔念珠菌感染进而早期治疗提供了线索。

目录

声明

摘要

缩略词表

一、前言

(一)实验材料

(二)实验方法

三、结果

(一)菌株鉴定

(二)LAMP技术特异性及敏感性验证

(三)qPCR特异性及敏感性验证

四、讨论

参考文献

六、全文总结

(一)主要结论

(二)工作展望

克柔念珠菌的诊断研究进展

在读期间发表论文和参加科研工作情况说明

致谢