牛奶中多种抗生素的悬浮芯片检测技术研究

摘要

食品安全问题是关系民生的重大问题，关系到每一个公民的身体健康和生命安全，也是中国政府一直以来非常关心的问题之一。其中，乳制品已经成为我国居民日常消费的重要食品之一，乳制品的安全问题也日益受到关注。在乳制品中，除了三聚氰胺等非法添加剂之外，抗生素残留是其中危害较大的污染物。为解决现有常规技术达不到对多种抗生素残留快速、灵敏和高通量的检测的问题，本研究建立了一种新型多种抗生素残留的高通量悬浮芯片检测技术和方法，实现了对牛奶中的抗生素快速、准确、和高效的定量检测
　　 本研究以五种常用于奶牛疾病治疗的抗生素(氯霉素、四环素、庆大霉素、链霉素和泰乐菌素)为靶标物，基于间接竞争法的免疫学检测原理，实现了对五种抗生素残留靶标物同时检测的目标；通过一系列的优化和筛选实验条件，使悬浮芯片检测的灵敏度、信号强度、稳定性都有了进一步的提高，同时还降低了检测成本；探索并成功应用了一种新的、适用于悬浮芯片检测的牛奶样品前处理技术，该技术处理快速，操作简单，对待测靶标物几乎没有影响，处理之后的样品对悬浮芯片检测的灵敏度、稳定性等方面没有负面影响；通过比对实验，进一步确定了悬浮芯片法检测的准确性，与常规检测方法相比，悬浮芯片法检测简便、快捷，操作简单，结果稳定可靠。
　　 本研究的研究内容主要包括以下几方面：
　　 1.不同抗生素抗原分子在微球上的包被偶联技术的研究采用戊二醛法和碳二亚胺法成功合成了部分抗生素的蛋白结合物；通过比较不同的包被浓度下所获得的报告荧光值，最终确定最佳的抗原包被量，利用EDC和NHS将不同的抗原偶联到微球上。
　　 2.Luminex悬浮芯片系统反应条件的选择与优化对反应缓冲液的离子强度、反应缓冲液的类型、悬浮芯片检测反应方式、最佳抗原抗体反应时间、试剂加入方式、抗体加入量和SA-PE稀释比例以及多通道检测时抗体使用量等检测条件进行筛选和优化。
　　 3.Luminex悬浮芯片系统对各种抗生素的同时检测与分析，包括各种抗生素的检测灵敏度、特异性测定以及方法的比对实验通过优化条件、摸索各种待测靶标物的浓度梯度，绘制出五种抗生素的单通道检测标准曲线，并在多通道检测抗体使用量优化的基础上，绘制出了五种抗生素的多通道检测标准曲线，利用Logistic回归对曲线进行拟合，曲线关系良好，决定系数R2>0.9945，灵敏度与国标方法相比具有明显的优势。
　　 通过悬浮芯片检测的特异性实验，证明了五种悬浮芯片微球与其对应的抗原之间可准确地相互识别；对于这五种抗生素的结构类似物的检测，除了对两种四环素类药物有一定的交叉反应，其余特异性良好，与多种药物均无交叉和干扰反应。
　　 采用传统的间接竞争ELISA法和液相色谱法检测各种抗生素残留，与悬浮芯片法进行比对研究，结果表明悬浮芯片法检测的灵敏度比这两种传统方法高，而且操作简单、检测快速(包括样品前处理，整个检测过程不超过2 h)和高通量的优势是这两种方法所不能比拟的。
　　 4.用于悬浮芯片检测的牛奶样品的前处理技术研究
　　 通过比较不同的处理方法，探索出了一种新的，适用于悬浮芯片技术的牛奶样品前处理方法。该方法简单，快速，有效，使得检测灵敏度和稳定性都有了较大的提高，为以后应用于其他食品的检测提供了思路。整个前处理过程可以在20分钟内完成。空白加标回收实验和实际样品的检测也证明，这种样品前处理方法效果良好，对待测靶标物和免疫反应影响小，完全可以用于悬浮芯片检测的样品前处理。
　　 5.Luminex悬浮芯片系统对牛奶实际样品的检测
　　 对经过前处理的牛奶样品进行检测，并与标准曲线比对，计算其中抗生素的含量。通过和同一样品的ELISA检测结果相比较，悬浮芯片检测的精确度较高，误差较小。
　　 五种抗生素的悬浮芯片实际样品检测范围分别为：泰乐菌素0.026～400ng/mL，庆大霉素0.4～25.6 ng/mL，四环素0.05～781.25 ng/mL，链霉素0.08～1250 ng/mL，氯霉素0.5～7812.5 ng/mL。
　　 悬浮芯片技术在国内外多应用于对蛋白质和核酸等大分子的检测，对牛奶中不同类型的抗生素的检测未见系统报道。本研究通过建立高通量的多种抗生素残留检测的悬浮芯片技术，实现了对实际样品中多种抗生素残留的高通量检测分析，检测方法灵敏、快速，误差较小，为牛奶中多种抗生素残留的快速检测提供了新方法，为检测试剂盒的研发奠定了基础。