发酵羊乳产ACE抑制肽乳杆菌的筛选及产肽条件优化

摘要

当今社会，高血压已成为一种常见的慢性病，严重危害着人们的健康。研究发现，一些乳杆菌在其发酵过程中会产生一类具有降血压功能的多肽——ACE抑制肽，这些多肽安全无毒，并且能够起到较好的降低血压的效果。国外已有相关降血压乳制品问世，而国内尚停留在ACE抑制肽的研究阶段，并且使用的发酵菌和原料也较为单一。陕西是羊乳大省，但羊乳产品却以附加值较低的羊奶粉为主，本研究使用陕西的优势资源羊乳作为原料乳，对于我国羊乳资源的开发利用，提高其附加值具有促进作用。
　　 本研究以ACE抑制率为指标，首先从28株益生乳杆菌中筛选得到了4株具有较强产肽能力的菌株，并通过16SrDNA测序法对它们进行了菌种鉴定;接着通过胃肠道模拟试验对这4株益生乳杆菌进行复筛，得到了产ACE抑制肽能力较强且耐受胃肠道消化的1株益生乳杆菌——保加利亚乳杆菌LB6;之后，以其为试验菌株，利用单因素试验和响应面设计分别对LB6发酵羊乳生产ACE抑制肽的产肽条件和发酵培养基进行了优化，确定了LB6的较适产肽条件和较优培养基成分。得到了以下结论:
　　 本课题所研究的28株益生乳杆菌中，有19株乳杆菌的发酵羊乳具有ACE抑制活性，抑制率最低的为2.27％，最高的为85.52％。其中使用罗伊氏乳杆菌LT33、保加利亚乳杆菌LB6、鼠李糖乳杆菌LR22和乳杆菌L69发酵的羊乳中ACE抑制率较高。
　　 通过16SrDNA菌种鉴定，LB6、LR22、LT33和L69均属乳杆菌属，其中LB6为德氏乳杆菌保加利亚亚种，LR22为鼠李糖乳杆菌，LT33为罗伊氏乳杆菌，乳杆菌L69为植物乳杆菌。
　　 在经历人工胃肠液的消化后，LB6和LT33的发酵羊乳ACE抑制率明显高于其他两株乳杆菌，而LB6发酵羊乳不论在人工胃液还是人工肠液中，其ACE抑制率均表现出更加稳定的特点。并且其发酵所需时间较短、凝乳效果较好。
　　 试验表明，一些在牛乳发酵过程中能够促进ACE抑制肽产生的发酵条件，在保加利亚乳杆菌发酵羊乳的过程中同样可以促进ACE抑制肽的产生。Plackett-Burman试验筛选结果表明，在众多因子中发酵温度、乳清粉浓度和乳酸钙浓度对于发酵羊乳的ACE抑制率影响较大。采用Box-Behnken试验得到优化后的发酵条件为:复原羊乳浓度11％，巴氏杀菌时间15min，发酵温度为35℃，培养时间12h，乳清粉浓度为0.8％，乳酸钙浓度为0.5％，接种量5％。验证结果与试验结果无显著性差异，ACE抑制率达到85.88±0.6％，高出对照组10.64％。
　　 通过单因素试验研究了在羊乳中添加不同物质对于保加利亚乳杆菌LB6生产ACE抑制肽的影响，经Plackett-Burman试验筛选得到了对于发酵羊乳中ACE抑制率影响较大的三个因子:大豆蛋白胨、葡萄糖和酪蛋白。经爬坡和Box-Behnken试验对LB6产ACE抑制肽培养基进行了优化，其成分为:复原羊乳11％，大豆蛋白胨0.30％、葡萄糖1.15％、酪蛋白0.15％。验证结果与试验结果无显著性差异，ACE抑制率高达92.31±0.5％，LB6活菌数达到1.04×108cfu/mL。
　　 本课题所优化得到的发酵羊乳具有较高的ACE抑制率，且在胃肠道中活性稳定，能够起到辅助降低血压的效果，对进一步开发降血压发酵羊乳或混合发酵的降血压酸羊乳产品提供了参考，也对提高我省羊乳产品的附加值具有重要意义。

目录

摘要

1 前言

1．1 ACE抑制肽

1．2．1 ACE抑制肽的降血压机理

1．2．2 我国高血压现状、成因及治疗

1．2．3 ACE抑制肽研究现状

1．2 益生菌发酵法产ACE抑制肽

1．3 本课题的意义及研究内容

2 材料与方法

2．1 材料

2．1．1 供试菌种

2．1．2 培养基

2．1．3 主要试剂

2．1．4 主要仪器及设备

2．2 技术路线与试验方法

2．2．1 技术路线

2．2．2 菌种活化

2．2．3 发酵羊乳制备及ACE抑制活性的体外测定

2．2．4 高产ACE抑制肽益生乳杆菌的初筛

2．2．5 菌种鉴定

2．2．6 胃肠道模拟试验

2．2．7 生长曲线测定

2．2．8 产肽条件的优化

2．3 分析检测方法

2．3．1 活菌数的测定

2．3．2 pH值的测定

2．3．3 酸度的测定

3 结果与讨论

3．1 高产ACE抑制肽益生乳杆菌的初筛

3．1．1 保加利亚乳杆菌发酵羊乳的ACE抑制率及pH值

3．1．2 嗜酸乳杆菌发酵羊乳的ACE抑制率及pH值

3．1．3 鼠李糖乳杆菌发酵羊乳的ACE抑制率及pH值

3．1．4 罗伊氏乳杆菌和植物乳杆菌发酵羊乳的ACE抑制率及pH值

3．1．5 干酪、副干酪乳杆菌和乳杆菌L69发酵羊乳的ACE抑制率及pH值

3．1．5 小结

3．2 高产ACE抑制肽菌株的菌种鉴定

3．2．1 菌体形态观察

3．2．2 16S rDNA测序

3．2．2 小结

3．3 LB6、LR22、LT33和L69发酵羊乳的胃肠道模拟试验

3．3．1 LB6、LR22、LT33和L69发酵羊乳消化前pH值及ACE抑制率

3．3．2 四种发酵羊乳在胃肠道模拟试验中的ACE抑制率变化

3．3．3 小结

3．4 保加利亚乳杆菌LB6的生长曲线

3．5 产肽条件的优化及效果分析

3．5．1 接种量对LB6发酵羊乳ACE抑制率的影响

3．5．2 温度对LB6发酵羊乳ACE抑制率的影响

3．5．3 复原羊乳浓度引起LB6发酵羊乳ACE抑制率的变化分析

3．5．4 杀菌时间影响LB6生长及ACE抑制率的效果分析

3．5．5 乳清粉浓度对LB6发酵羊乳ACE抑制率变化的影响

3．5．6 添加酪蛋白水解物影响LB6发酵羊乳ACE抑制率的效果

3．5．7 乳酸钙对LB6发酵羊乳ACE抑制率的影响

3．5．8 不同储藏温度下LB6发酵羊乳ACE抑制率的变化

3．5．9 产肽条件的筛选及优化

3．5．10 小结

3．6 发酵培养基的筛选优化及效果分析

3．6．1 酪蛋白胨浓度对LB6发酵羊乳ACE抑制率变化的影响

3．6．3 酪蛋白对LB6发酵羊乳ACE抑制率的影响

3．6．4 葡萄糖影响LB6发酵羊乳ACE抑制率的效果

3．6．5 乳糖浓度变化对LB6发酵羊乳ACE抑制率的作用

3．6．6 抗坏血酸影响LB6生长及ACE抑制率的效果分析

3．6．7 添加磷酸二氢钙对LB6发酵羊乳ACE抑制率的作用效果

3．6．8 磷酸二氢钾对LB6发酵羊乳ACE抑制率的影响

3．5．9 LB6发酵羊乳产ACE抑制肽培养基的筛选及优化

3．5．10 小结

4 结论、创新点及展望

4．1 结论

4．2 创新点

4．3 展望

致谢

参考文献

附录A：LB6的16S rDNA测序图谱

附录B：LR22的16S rDNA测序图谱

附录C：LT33的16S rDNA测序图谱

附录D：L69的16S rDNA测序图谱

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