嗜热乳链球菌微囊化发酵分离耦合生产Nisin的研究

摘要

乳链菌肽(Nisin)是乳酸链球菌或乳酸乳球菌代谢产生的一种小分子多肽。因其对G+菌及其芽孢有抑制作用，但对人体无毒副作用的特点，而被作为一种天然绿色的食品防腐剂广泛用于食品行业。本课题组前期初步构建了以海藻酸钠(A)和壳聚糖(C)为壁材液芯微囊化嗜热链球菌6032发酵生产Nisin的工艺，另外有学者则对泡沫分离Nisin进行了研究，但将两种工艺联合起来耦合生产Nisin的研究尚未见报道。本课题，拟将微囊化发酵和泡沫分离两种工艺耦合起来，实现细胞微囊连续循环发酵及在线分离解除产物抑制，以期提高Nisin的生产速率和产率。
　　本课题研究的主要内容及结果:
　　(1)以挤压法制备ACA嗜热乳链球菌6032液芯微囊，在单因素试验基础上，利用响应面法对制备工艺条件进行了优化，确定了制备嗜热乳链球菌6032液芯微囊的最适工艺条件为壳聚糖溶解时间2h、搅拌速度236r/min、温度33.7℃、滴加速度4.9mL/min;用此条件下制得的细胞微囊发酵生产Nisin，Nisin效价为5242.00IU/mL、吸光度OD600为0.182。在普通光学显微镜40倍下和倒置显微镜下对该细胞微囊进行观察:细胞微囊大部分呈球形且大小相近，粒径约为790um，膜厚度约为22.5um。
　　(2)为了奠定嗜热乳链球菌6032液芯微囊化发酵泡沫分离耦合生产Nisin的基础，对上述条件制得的细胞微囊的发酵及泡沫分离条件进行优化。①通过响应面试验，确定了适宜的发酵条件为发酵pH6.1、培养温度28.7℃、发酵时间20h，Nisin效价为5460.00IU/mL、微囊破损率为0.71％;基于泡沫分离的最适培养基组分为氯化钠1.50％、氯化钙1.45％、玉米浆浓度为24.5％，在此条件下，Nisin效价为5798.23IU/mL，Nisin富集比可达到7.4。②对通入空气和流加饱和NaHCO3溶液产生CO2两种泡沫分离产生方式进行比较，表明通入空气的更适用于耦合生产;利用正交试验对发酵结束时空气泡沫分离Nisin的条件进行优化，确定出最佳的工艺参数为:泡沫层高度11cm、温度34℃、pH7.0、分离时间60min、通气速率0.15L/min;在此条件下，Nisin富集比为8.4，回收率为83.89％，细胞富集比为0.221％。
　　(3)研究了ACA嗜热乳链球菌6032液芯微囊化发酵泡沫分离耦合生产Nisin工艺，以上述优化的泡沫分离工艺参数作为对照组（在发酵20-21h，以0.15L/min的气速通气），以嗜热乳链球菌6032调控pH分批发酵为基础，设计了两种发酵泡沫分离耦合工艺，即分别在发酵的18-20h、14-22h，以0.10L/min和0.05L/min的气速进行泡沫分离（分别记为工艺一和工艺二），与不通气组相比，两种工艺在分离结束后发酵液的Nisin效价继续增大;工艺二比工艺一更适合于耦合生产，且工艺二中Nisin的富集比（达到13.44）更高，细胞富集比较低，最大Nisin效价达到7960.16IU/mL，比对照组的提高了25.22％。

目录

摘要

1 文献综述

1．1 乳链菌肽的简介

1．1．1 乳链菌肽的分子结构与性质

1．1．2 乳链菌肽的抑菌作用机理

1．1．3 乳链菌肽的应用

1．2 微囊化发酵生产乳链菌肽的现状

1．2．1 微囊化乳酸菌的材料

1．2．2 微囊化乳酸菌的制备方法及其发酵生产

1．3 乳链菌肽发酵与分离提取的现状

1．3．1 乳链菌肽发酵的现状

1．3．2 乳链菌肽分离纯化的现状

1．3．3 发酵分离耦合生产Nisin的现状

1．3．4 微囊化发酵泡沫分离耦合生产Nisin的现状

1．4 本课题研究目的、意义

1．5 本课题研究内容

2 ACA嗜热乳链球菌6032液芯微囊制备工艺条件的优化

2．1 引言

2．2 材料与仪器

2．2．1 菌株

2．2．2 实验主要仪器

2．2．3 实验主要药品与试剂

2．2．3 溶液与培养基配制

2．3 方法

2．3．1 实验方法

2．3．2 分析方法

2．4 结果与讨论

2．4．1 不同因素对微囊制备的影响

2．4．2 响应面法优化微胶囊制备的工艺条件

2．4．3 ACA嗜热乳链球菌6032液芯微囊表征

2．5 小结

3 嗜热乳链球菌液芯微囊发酵与泡沫分离条件的研究

3．1 引言

3．2 材料与仪器设备

3．2．1 菌株

3．2．2 实验仪器与设备

3．2．3 主要药品与试剂

3．2．4 溶液与培养基的配制

3．3 方法

3．3．1 实验方法

3．3．2 分析方法

3．4 结果与讨论

3．4．1 ACA嗜热乳链球菌6032液芯微囊化发酵环境条件的优化

3．4．2 ACA嗜热乳链球菌6032液芯微囊化发酵培养基组分含量的优化

3．4．3 泡沫产生方式的研究

3．4．4 Nisin泡沫分离条件的优化研究

3．5 小结

3．5．1 ACA嗜热乳链球菌6032液芯微囊化发酵生产Nisin条件的优化

3．5．2 对Nisin泡沫分离条件的优化

4 ACA嗜热乳链球菌6032液芯微囊发酵泡沫分离耦合生产Nisin的研究

4．1 引言

4．2 材料与仪器

4．2．1 菌株

4．2．2 主要实验仪器与设备

4．2．3 主要试剂

4．3 方法

4．3．1 实验方法

4．3．2 分析方法

4．4 结果与讨论

4．4．1 发酵分离耦合工艺的研究

4．4．2 耦合批次对液芯微囊化发酵生产Nisin的影响

4．5 小结

5．结论、创新点和展望

5．1 结论

5．2 创新点

5．3 展望

致谢

参考文献

攻读硕士学位期间发表的成果

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