酶解羊乳酪蛋白制备抗氧化肽及其分离纯化

摘要

自从自由基的理论提出以来，人们发现机体的许多疾病都与体内氧化反应产生的自由基相关，因此抗氧化肽就成为研究的热点。抗氧化肽可以清除自由基，阻止氧化反应的发生，从而帮助机体抵御疾病。食源性抗氧化肽具有安全有效、无毒副作用的优点，备受关注。目前，乳源抗氧化肽的研究主要集中在牛乳，对于羊乳的研究尚少。陕西省具有丰富的羊乳资源，但羊乳产品相对单一，主要以羊奶粉为主，附加值不高。开展羊乳酪蛋白抗氧化肽的研究，可以开发羊乳酪蛋白抗氧化肽的产品，丰富羊乳产品种类，提升羊乳产品的功效和附加值。
　　本课题以羊乳为原料，以羊乳酪蛋白为底物，选用七种蛋白酶水解羊乳酪蛋白，以水解度DH、DPPH自由基清除率、螯合铁离子能力和超氧阴离子清除率为指标，筛选出具有抗氧化活性高的蛋白酶。单因素、析因实验以及响应面设计来优化工艺条件。同时，将酶解液利用超滤、大孔树脂脱盐及凝胶色谱等分离纯化抗氧化肽，研究结论如下:
　　1.以水解度DH和DPPH自由基清除率为指标，选用蛋白酶K、Alcalase酶、胰蛋白酶、风味蛋白酶、菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶和中性蛋白酶在各自适宜条件下水解羊乳酪蛋白。结果表明，Alcalase酶为水解羊乳酪蛋白制备抗氧化肽的最佳用酶，Alcalase酶和木瓜蛋白酶为水解羊乳酪蛋白制备抗氧化肽的最佳复合酶。
　　2.单因素实验考察了不同水解条件对Alcalase酶水解羊乳酪蛋白制备抗氧化肽的影响，析因实验筛选出主因子，结果表明，影响羊乳酪蛋白制备抗氧化肽的主要因素是pH、底物浓度和时间。爬坡实验和响应面设计确定了最佳工艺参数:温度69℃、pH8.9、底物浓度4.4％、酶加量2％及时间172min，在此条件下，羊乳酪蛋白抗氧化肽DPPH自由基清除率为（68.37±1.31）％，螯合铁离子能力为(89.04±0.77)％，超氧阴离子清除率为(46.58±1.08)％。
　　3.单因素实验考察了不同水解条件对复合酶水解羊乳酪蛋白制备抗氧化肽的影响，析因实验筛选出主因子，结果表明，影响羊乳酪蛋白制备抗氧化肽的主要因素为温度、酶加量和复合酶配比。爬坡实验和响应面设计确定了最佳工艺参数:温度61℃、pH为9、底物浓度4％、酶加量5.6％、复合酶配比（EAlcalase∶E木瓜蛋白酶）为1.8∶1及时间180min，在此条件下，羊乳酪蛋白抗氧化肽DPPH自由基清除率为（73.81±0.93）％、螯合铁离子能力为（93.44±1.46）％以及超氧阴离子清除率为（51.69±1.17）％。
　　4.采用不同截留分子量的超滤膜超滤酶解液。研究表明，分子量低于1kDa的组分DPPH自由基清除率最大，为81.25％，IC50的值最小，为0.842mg/mL，表明分子量小于1kDa的肽链抗氧化性强。DA201-C大孔树脂进一步分离1kDa酶解液，调节样品pH为4的条件下吸附，70％浓度乙醇洗脱，脱盐后的DPPH自由基清除率和IC50分别为83.62％和0.753mg/mL。
　　5.Sephadex G-15凝胶纯化大孔树脂脱盐样品。以蒸馏水为洗脱剂，上样浓度80mg/mL，洗脱流速0.8 mL/min条件下分离得到三个组分Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，其中组分Ⅱ的活性最高，DPPH自由基清除率和IC50值分别为85.61％和0.543mg/mL。RP-HPLC法分析组分Ⅱ发现，分离的样品并非单一组分，还需对其进一步的纯化。
　　本研究制备的羊乳酪蛋白抗氧化肽具有较高的抗氧化活性，可作为添加剂用于开发抗氧化肽产品和功能性羊乳产品，促进我省羊乳产业的健康快速发展。

目录

摘要

1 前言

1．1 自由基

1．2 抗氧化肽研究进展

1．2．1 非乳源抗氧化肽

1．2．2 乳源抗氧化肽

1．2．3 抗氧化肽制备方法

1．2．4 抗氧化肽的分离纯化

1．3 羊乳及羊乳蛋白多肽的研究进展

1．4 本课题的意义及研究内容

2 材料与方法

2．1 材料

2．1．1 主要材料与试剂

2．1．2 主要设备

2．2 技术路线及实验方法

2．2．1 技术路线

2．2．2 脱脂羊乳的制备

2．2．3 羊乳酪蛋白的提取[65]

2．2．4 水解羊乳酪蛋白最佳用酶的选择

2．2．5 酶解酪蛋白制备抗氧化肽工艺的优化

2．2．6 羊乳酪蛋白抗氧化肽的超滤分离

2．2．7 大孔树脂DA201-C对酶解液初步分离

2．2．8 凝胶色谱分离纯化

2．2．9 RP-HPLC法分析肽组成图谱[66]

2．3 测定方法

2．3．1 蛋白质浓度的测定

2．3．2 肽浓度的测定

2．3．3 蛋白水解度的测定[69]

2．3．4 抗氧化肽的测定

2．3．7 IC50的测定

3 结果与讨论

3．1 羊乳酪蛋白制备抗氧化肽最佳用酶的选择

3．1．1 蛋白质标准曲线测定

3．1．2 最佳用酶的选择

3．2 Alcalase酶解羊乳酪蛋白制备抗氧化肽

3．2．1 温度对酶解羊乳酪蛋白水解度及抗氧化性效果的影响

3．2．2 pH对酶解羊乳酪蛋白水解度及抗氧化性的影响

3．2．3 底物浓度变化对水解度及抗氧化性效果的影响分析

3．2．4 酶加量对水解羊乳酪蛋白效果的分析

3．2．5 水解时间对酶解液抗氧化性及水解度的影响分析

3．2．6 Alcalase酶解羊乳酪蛋白影响因素的筛选

3．2．7 最陡爬坡实验结果分析

3．2．8 Alcalase酶解酪蛋白工艺条件优化

3．3 复合酶水解羊乳酪蛋白制备抗氧化肽

3．3．1 温度对复合酶解液水解度及抗氧化性的影响

3．3．2 pH对复合酶水解羊乳酪蛋白效果的影响

3．3．3 底物浓度对复合酶制备抗氧化肽的效果分析

3．3．4 复合酶加量对酶解液水解度及抗氧化性影响分析

3．3．5 复合酶配比对酶解液水解度及抗氧化性的影响

3．3．6 水解时间引起复合酶解液水解度及抗氧化性的变化

3．3．7 复合酶酶解羊乳酪蛋白主因子筛选

3．3．8 爬坡实验与结果分析

3．3．9 复合酶酶解羊乳酪蛋白工艺条件优化

3．4 羊乳酪蛋白抗氧化肽的超滤

3．4．1 肽的标准曲线测定

3．4．2 抗氧化肽的超滤分离

3．5 抗氧化肽的DA201-C大孔树脂脱盐

3．5．1 DA201-C大孔树脂对抗氧化肽的静态吸附曲线

3．5．2 DA201-C大孔树脂对抗氧化肽的静态解吸曲线

3．5．3 pH对DA201-C大孔树脂吸附抗氧化肽的影响

3．5．4 乙醇浓度对DA201-C大孔树脂解吸抗氧化肽的影响

3．5．5 羊乳酪蛋白酶解物脱盐前后抗氧化性的测定

3．6 凝胶色谱分离纯化抗氧化肽

3．6．1 不同洗脱剂对抗氧化肽凝胶色谱纯化效果的影响

3．6．2 上样浓度对抗氧化肽凝胶色谱图的影响

3．6．3 洗脱流速对抗氧化肽凝胶色谱纯化效果分析

3．6．4 葡聚糖SephadexG-15分离抗氧化肽的凝胶图谱

3．7 RP-HPLC法组分分析

4．结论、创新点及展望

4．1 结论

4．2 创新点

4．3 展望

致谢

参考文献

攻读硕士学位期间发表的成果

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