三种弧菌外膜蛋白K基因的克隆、表达及其潜在应用的研究

摘要

本研究根据哈维氏弧菌0mpK基因序列，3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)基因序列和酒精酵母菌表面展示质粒载体pYD1上的多克隆位点设计引物，从哈维氏弧菌基因组DNA和质粒pET-OmpK-GAPDH中通过PCR技术扩增外膜蛋白基因和融合基因0mpK-GAPDH，把该基因连接到表面展示质粒载体pYD1上，转化用于表面展示的酵母EBY100菌株中，以不含载体和含空载体的酵母菌为对照，加2％(w/v)的半乳糖诱导36 h后，利用免疫荧光法在荧光显微镜下检测到了展示在酵母菌细胞表面上的外膜蛋白。 同时利用大肠杆菌表达载体pQE-30，构建了哈维氏弧菌，副溶血弧菌，溶藻胶弧菌三种弧菌外膜蛋白K的重组大肠杆菌，IPTG诱导4h后能够在大肠杆菌M15中高效表达了的融合蛋白。通过诱导表达用Ni2+亲和柱纯化了重组的三种弧菌的外膜蛋白K，SDS-PAGE检测分子量分别为29 kDa，30 kDa，30 kDa。 用展示有哈维氏弧菌外膜蛋白k的酵母菌细胞对大菱鲆进行注射免疫，采用间接ELISA的方法，利用上述制备的重组哈维氏弧菌外膜蛋白k检测免疫鱼类血清中抗体的产生；间接ELISA对大菱鲆特异抗体检测结果表明，实验组有效价，说明这种以酒精酵母为载体的活疫苗可以刺激鱼类产生一定得抗体，但其平均效价却很低。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章文献综述

1.1前言

1.2海水鱼类弧菌病研究概况

1.3防治海洋鱼类弧菌病研究概况

1.4海洋鱼类病原菌的主要保护性抗原研究进展

1.5弧菌主要外膜蛋白研究进展

1.6微生物的表面展示及应用

1.7论文研究的目的和意义

第二章哈维氏弧菌OmpK基因和OmpK-GAPDH融合基因的克隆及其在酒精酵母细胞表面展示

1前言

2材料与方法

2.1材料

2.2方法

3结果

3.1目的基因扩增结果

3.2 pMD19-T-OmpK simple和pMD19-T-OmpK-GAPDH simple酶切鉴定结果

3.3 pMD19-T-mpK和pMD19-T-OmpK-GAPDH的测序鉴定

3.4重组质粒pYD1-OmpK和pYD1-OmpK-GAPDH的构建

3.5酵母菌落PCR筛选阳性转化子

3.6免疫荧光检测

4讨论

5本章小结

第三章哈维氏弧菌外膜蛋白k基因的克隆及在大肠杆菌中的表达和纯化

1前言

2材料与方法

2.1材料

2.2方法

3结果

3.1哈维氏弧菌外膜蛋白k基因的克隆

3.2 pMD19-VhOmpK simple双酶切结果验证

3.3 pQE-30-VhOmpK表达载体构建双酶切验证

3.4 pQE-30-VhOmpK在大肠杆菌中的诱导表达

3.5诱导条件的确定与蛋白的纯化

4讨论

5本章小结

第四章以酒精酵母为载体的哈维氏弧菌外膜蛋白基因工程活疫苗对大菱鲆幼鱼的免疫效果的初步研究

1前言

2材料与方法

2.1材料

2.2方法

3结果与讨论

4本章小结

第五章副溶血弧菌，溶藻胶弧菌外膜蛋白K基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达和纯化

1 前言

2材料与方法

2.1材料

2.2方法

3结果

3.1副溶血弧菌和溶藻胶弧菌外膜蛋白k基因的克隆

3.2 pMD19-VpOmpK simple和pMD19-VaOmpK simple双酶切结果验证

3.3 pQE-30-VpOmpK和pQE-30-VaOmpK表达载体构建双酶切验证

3.4 pQE-30-VhOmpK在大肠杆菌中的诱导表达

3.5两种弧菌外膜蛋白k的纯化

4讨论

5本章小结

总结与展望

本研究的创新点

参考文献

附录

致谢

个人简历

攻读硕士期间发表的学术论文