拟态弧菌外膜蛋白OmpU基因的克隆表达及其免疫保护性研究

摘要

拟态弧菌(Vibrio mimicus)是危害水产动物的重要病原菌之一，不仅可引起鱼蟹类严重的腹水病，而且还可通过水产动物和水产品感染人类，引起腹泻和食物中毒。腹水病是我省鱼蟹类养殖中常见的疫病之一，控制腹水病的发生和蔓延已成为水产养殖业持续发展的关键。细菌外膜蛋白黏附素黏附定植于宿主组织细胞表面是细菌感染的重要初始环节，否则细菌就不能在局部定居，继而产生毒素或侵入深部组织，引起感染发生。研制以抗黏附作用为主的外膜蛋白疫苗已成为免疫防治细菌感染最有效的措施之一。为此，本课题以拟态弧菌外膜蛋白OmpU为靶蛋白，在对ompU克隆表达的基础上研究融合重组蛋白的抗原性和免疫保护性，旨在为研制OmpU基因工程疫苗奠定了基础。 首先，对拟态弧菌安徽分离株进行ompU PCR扩增、克隆测序和生物信息学分析。研究中根据霍乱弧菌参考株ompU全序列，设计合成2对分别针对ompU部分序列和全序列的特异性引物，以拟态弧菌基因组DNA为模板，PCR扩增ompU，构建重组质粒pMD18-T-OmpU，筛选阳性重组克隆进行序列测定和生物信息学分析。结果显示：4株拟态弧菌安徽分离株均携带ompU，ompU片段长为849bp，该基因片段的核苷酸同源性在拟态弧菌安徽分离株之间以及与霍乱弧菌参考株之间均较高，分别介于94.2％～100％和83.4％～87.6％之间。拟态弧菌HX4菌株ompU ORF长1 03 8 bp，编码346个氨基酸，OmpU相对分子量为36.95kDa，其N端前22个氨基酸组成信号肽，N末端氨基酸序列与流感嗜血杆菌HMW黏附素序列具有相似性，在5aa～21aa和201aa～218aa之间有两个明显跨膜域，其二级结构以α-螺旋和β-折叠为主，间或有β转角和无规卷曲，DNAstar软件预测出在OmpU的20aa-34aa、36aa-67aa、73aa-81aa、88aa-112aa、123aa-134aa、143aa-160aa、164aa-174aa、177aa-200aa、217aa-227aa、244aa-259aa、275aa-288aa、295aa-303aa和314aa-340aa之间存在抗原表位。表明拟态弧菌OmpU是一种具有较好保守性和抗原性的黏附素孔蛋白。 其次，构建重组质粒pGEX-4T-1-OmpU并进行原核表达。研究中重新设计l对包含．BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ酶切位点的引物，扩增ompU全序列，构建重组表达质粒pGEX-4T-OmpU并转化至Ecoli BL21(DE3)感受态细胞进行原核表达、产物鉴定和可溶性分析。结果显示重组表达质粒经IPTG诱导培养4h后，能在E. coli BL21中表达分子量约为62.9 kDa的融合蛋白GST-OmpU。表明ompU得到了良好的融合表达。 最后，采用免疫印迹和免疫保护性试验测定融合蛋白GST-OmpU的抗原性和免疫保护性。研究中将纯化的Omps、GST-OmpU以及诱导表达菌裂解液经SDS-PAGE电泳后转印至PVDF膜进行Western blot检测。同时以融合蛋白GST-OmpU免疫接种实验小鼠，四次免疫后进行免疫保护性试验。结果显示GST-OmpU和Omps诱导小鼠产生的免疫血清可以相互识别GST-OmpU和Omps，GST-OmpU保留了Omps的某些抗原性，免疫小鼠可部分抵抗50LD<,50>拟态弧菌的攻击，免疫保护率为60％。表明OmpU是拟态弧菌的保护性抗原之一。综上所述，本研究从分子水平揭示了ompU在拟态弧菌安徽分离株间以及霍乱弧菌参考株间具有高度同源性，OmpU是一种具有较好抗原性和保守性的黏附素孔蛋白。成功构建了pGEX-4T-1-OmpU重组表达质粒，重组OmpU具有较好的免疫保护性，可作为外膜蛋白疫苗的候选抗原。

目录

文摘

英文文摘

声明

文献综述

1引言

2材料与方法

2.1实验菌株

2.2工程菌和质粒

2.3酶类与主要试剂(盒)

2.4实验动物与免疫血清

2.5主要培养基与溶液的配制

2.6主要仪器

2.7鼠抗拟态弧菌外膜蛋白免疫血清制备

2.7.1细菌外膜蛋白的提取

2.7.2免疫原的制备

2.7.3免疫接种

2.7.4鼠抗Omps抗体的检测

2.8拟态弧菌ompU的克隆与序列分析

2.8.1细菌培养与基因组DNA提取

2.8.2引物设计与合成

2.8.4 PCR产物的回收与纯化

2.8.5 PCR产物的单酶切鉴定

2.8.6 PCR产物与pMD18-T载体的连接

2.8.7感受态细胞的制备

2.8.8连接产物的转化

2.8.9重组菌的筛选与鉴定

2.8.10 ompU的序列测定与分析

2.9重组质粒pGEX-4T-1-OmpU的构建与表达

2.9.1引物设计与合成

2.9.2 HX4菌株ompU PCR扩增与PCR产物纯化

2.9.3 PCR纯化产物与表达质粒的双酶切

2.9.4双酶切产物的回收与纯化

2.9.5 ompU与表达质粒的连接

2.9.6连接产物的转化

2.9.7重组表达质粒的鉴定

2.9.8重组表达质粒pGEX-4T-1-OmpU的原核表达与鉴定

2.10重组蛋白OmpU的免疫保护性测定

2.10.1GST-OmpU融合蛋白的提取

2.10.2GST-OmpU融合蛋白的浓度测定

2.10.3重组OmpU蛋白的抗原性测定

2.10.4重组OmpU蛋白的免疫保护性测定

3结果与分析

3.1鼠抗拟态弧菌外膜蛋白免疫血清制备

3.2 ompU PCR扩增与PCR产物单酶切鉴定

3.3重组质粒的鉴定

3.4 ompU序列测定与分析

3.4.1 ompU片段同源性分析

3.4.2 OmpU结构与抗原表位的预测分析

3.5重组表达质粒pGEX-4T-1-OmpU的构建与鉴定

3.6重组蛋白OmpU的鉴定

3.7表达产物的定位与可溶性分析

3.8重组OmpU的抗原性

3.9重组OmpU的免疫保护性

4讨论

4.1鱼蟹类腹水病的免疫防治方法

4.2拟态弧菌安徽分离株ompU的序列分析

4.3拟态弧菌安徽分离株OmpU的原核表达

4.4包涵体的变性与复性

4.5重组OmpU的免疫保护性分析

5结论

参考文献

附录

致谢

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