哈维氏弧菌外膜蛋白OmpW基因克隆、表达及DNA疫苗的免疫效果

摘要

参照GenBank上登录的哈维氏弧菌外膜蛋白OmpW基因序列,设计引物扩增OmpW的开放阅读框,序列分析结果显示该基因全长645 bp.将其定向克隆到原核表达载体pET-32a(+),在大肠杆菌BL21中成功表达出带His-tag的融合蛋白,融合蛋白分子量约为43.8 ku,且主要以包涵体形式存在.优化的表达条件为37℃,IPTG浓度0.1 mmol/L,诱导时间5h.将纯化的融合蛋白免疫SPF昆明小鼠制备多克隆抗体,ELISA方法检测抗体效价达1∶30 000,Western-blot结果表明鼠抗OmpW血清能与诱导后的重组蛋白发生特异反应,提示OmpW可能是哈维氏弧菌的一种重要保护性抗原.为进一步研究哈维氏弧菌外膜蛋白OmpW基因DNA疫苗对红笛鲷的免疫保护效果,构建了真核表达重组质粒pcDNA-OmpW,然后将真核质粒免疫接种红笛鲷.PCR结果显示,免疫接种后第7～28天,在红笛鲷的肌肉、头肾、肝脏和脾脏组织中均存在质粒分布;RT-PCR结果显示,免疫接种后第7～28天,红笛鲷上述组织均有目的基因的表达.ELISA结果表明,红笛鲷体内血清产生了抗OmpW蛋白的高效价抗体.Western-blot分析表明,DNA疫苗免疫后红笛鲷体内表达了相应的目的蛋白,并诱导产生了相应抗体.攻毒实验结果表明,免疫保护率高达60％,可见pcDNA-OmpW可作为红笛鲷预防哈维氏弧菌感染的有效候选疫苗之一.