白粉病菌诱导的小麦抑制消减文库构建及部分差异基因克隆

摘要

小麦白粉病是由专性寄生菌禾布氏白粉菌(Erysiphe graminis DC.f.sp.tritici Marchal)引起的真菌性病害，在全世界范围均有发生，在湿度大的地区发病尤为严重。小麦从一叶期到衰老均会受到白粉菌的威胁，严重影响小麦产量。改变耕作方式、使用农药等化学手段在一定程度上可以降低白粉病的发生，但易受到气候等条件的影响、也会增加人力、财力和物力，更重要的是会造成严重的环境污染，影响人类的健康。推广抗性品种成为目前最为经济和有效的措施。由于白粉菌生理小种的变异速度快，单一抗性品种的抗病性易丧失，因此发现与利用新的抗病基因、培育具有多个抗病基因聚合的持久抗病品种具有重要意义。本研究通过抑制性消减杂交技术，获得白粉病诱导的小麦差异表达序列，并对部分差异基因进行了克隆和分析。主要结果如下：
　　 1、消减文库的构建
　　 本研究利用本实验室培育的异附加系小麦SN6306为材料构建白粉病菌诱导的消减文库，筛选鉴定出一些与光合作用、蛋白质合成、细胞结构、信号转导、转录、糖代谢、抗病与防御等相关的序列，其中有18条与抗病及防御反应相关的EST序列。
　　 2、小麦TaPrxQ基因的克隆及序列分析
　　 通过消减文库得到的序列设计引物，利用PCR方法在SN6306的cDNA中克隆到了一个新的TaPrxQ基因cDNA序列，通过相似性比对分析显示TaPrxQ同已报道的HvPrx的氨基酸序列具相似性达到88％，结合进化树分析结果，推断TaPrxQ属于PrxQ类。TaPrxQ基因不含有内含子，全长943bp，cDNA序列包含927bp的开放阅读框，编码308个氨基酸残基，其等电点为9.41，分子量32.4kDa。TaPrxQ基因的克隆与分析为基因功能的研究奠定了基础。
　　 3、小麦TaRUB1基因的克隆、序列分析及功能分析
　　 通过消减文库得到的序列设计引物，利用PCR方法在SN6306的cDNA中克隆到了一个泛素相关蛋白的cDNA序列命名为TaRUB1。TaRUB1 cDNA序列全长500bp，其开放阅读框编码153个氨基酸残基，聚类分析揭示其在所有小麦同源序列中的独特位置，可能预示着其具有特殊的功能。TaRUB1基因前半部分编码泛素蛋白，后半部分编码NEDD8。用定量PCR技术分析TaRUB1在白粉菌诱导SN6306后的0h，24h，48h及72h的表达变化。结果显示TaRUB1在SN6306中受到白粉菌诱导后立即出现上调表达，并在48h时达到表达高峰。构建TaRUB1的植物表达载体转化拟南芥，发现在干旱和盐胁迫的条件下转TaRUB1拟南芥植株生长比野生型植株萌发率显著提高，生长旺盛，对干旱和盐胁迫具有一定的抗性，过量表达TaRUB1基因使拟南芥抵御逆境的能力得到提高，并且转TaRUB1拟南芥植株的花期提前。对TaRUB1拟南芥植株与野生型植株接种活体营养性病菌PstDC3000及腐生型病原菌Alternaria brassicicola，观察发现转TaRUB1拟南芥植株的感病情况比野生型的感病情况轻，说明转TaRUB1基因提高了拟南芥对活体营养型病原菌及腐生型病原菌的抗性水平，TaRUB1可能响应植株的抗病反应。这些结果为该基因的应用奠定了基础。