cDNA文库基础上cDNA消减杂交差异显示方法

摘要

cDNA文库基础上cDNA消减杂交差异显示方法，是一种分子生物学基因克隆分析方法，属于分子生物学领域。它是利用cDNA文库载体的限制性内切酶酶切位点，酶切选代表制备两文库扩增子，进行两文库扩增子间的双向一轮消减杂交，在各自一轮差异产物间进行双向二轮消减杂交，两轮差异产物标记同位素后引入mRNA差异显示技术进行差异分析。该方法为cDNA文库提供了新的应用前景，为克隆低丰度弱差异的基因提供了有效的手段。

说明书

cDNA文库基础上cDNA消减杂交差异显示方法(SHDD)是一种分子生物学基因克隆分析方法，属于分子生物学领域。

现有的基因克隆方法很多，据文献报道最通用的方法主要有两种，一种是cDNA代表性差异分析方法(cDNA RDA)，一种是mRNA差异显示方法(mRNA DD)。

(一)cDNA代表性差异分析方法(cDNA RDA)

基因组消减杂交方法是cDNA RDA建立的工作基础，所谓基因组消减杂交就是为了从两种相关的DNA样本(检测DNA和驱动DNA)中分离出检测DNA所具有的特异性序列，一定量的检测DNA(TesterDNA)与过量的驱动DNA(Driver DNA)进行杂交，使检测DNA中与驱动DNA相同的大部分序列发生杂和性复性，而检测DNA中特有的DNA片段发生自身复性，从而被分离出来。cDNA RDA方法在经典基因组消减杂交方法基础上引入了PCR扩增为主的动力学富集过程，通过消减两样本间的等同信息、富集差异信息，以其较高的特异性特点在克隆、鉴定不同发育阶段、不同周期时相、药物、细胞因子或病原体诱导前后组织细胞差异表达的基因等研究领域已得到广泛的应用。但是该方法存在以下几点不足：(1)经典的cDNA RDA方法采用溴乙锭显带，通常需经过三轮消减杂交才可获得明显的差异条带，较高的消减杂交比例以及每轮杂交后的多轮PCR扩增导致驱动DNA、一轮差异产物(DP1)、二轮差异产物(DP2)的片段群分布趋势依次递减，在二轮和三轮消减杂交中就存在了驱动DNA与一轮和二轮差异产物片段群间的不均衡消减杂交问题。驱动DNA与一轮和二轮差异产物的重叠区，也即差异产物片段群的偏长区域遭受较高消减杂交比例的抽提而发生信息量丢失；差异产物片段群的偏短区域在驱动DNA中仅有很少的对应序列，遭受的抽提效果较弱从而作为假阳性信息出现。这一发现为利用经典的cDNA RDA方法获得的差异产物中存在的信息量偏低和假阳性问题提供了一种合理的解释。(2)采用经典的cDNA RDA方法只能检测两样本DNA之间的差异，并且只能获得检测DNA中表达水平增高的mRNA差异信息，不能同时获得表达水平下调的信息。(二)mRNA差异显示方法(mRNA DD)

mRNA DD方法利用是随机引物和锚定引物对两种不同来源的mRNA信息群进行聚合酶链式反应扩增(PCR)，扩增产物行变形聚丙烯酰胺凝胶电泳，对比挑选差异表达片段。采用mRNA DD方法可同时比较多个样本间基因表达的差异，并可同时检测表达“上调”及“下调”的基因；对目的序列的扩增依赖于随机引物与锚定引物的不同组合，而不是依赖于目的序列的丰度，而且同位素的应用也有利于筛查得到较低丰度差异表达的信息。自1992年建立mRNA DD方法建立以来，人们已利用该技术以及在此基础上进一步改良的方法获得了数目可观的肿瘤相关基因。经过数年的实践，人们也发现了这项技术的一些不足之处，主要包括：(1)假阳性率高：许多研究表明，mRNA差异显示技术所呈现的差异条带有70％以上并不能为Northern印迹杂交及反向Northern印迹杂交等方法所证实。分析原因，主要与以下因素有关：随机引物特异性低；mRNA样品易发生降解或存在DNA的污染；由于使用3′端锚定引物，通过该方法获得的大多数差异条带仅含有3′端非翻译区(3′-UTR)的一段短片段信息，而该区域序列相对保守，使得以3′端cDNA片段作探针进行Northern印迹杂交可能出现假阳性问题。(2)对低丰度mRNA检出率低：真核细胞中，相当数量的mRNA属于低丰度信息，86％的基因仅占mRNA总量的25％，由于PCR的竞争性扩增，mRNA DD技术对克隆高丰度mRNA有明显的倾向性。(3)巨大的工作量问题：由于凝胶差异显示前该方法不对匹配样本中的等同信息进行消减，使得电泳结果显示的单一条带位置含有1-10种不同的cDNA序列，平均4种，进一步分离鉴定这些信息已成为mRNA DD最为耗时、耗力的步骤。而且由于不同的随机引物结合到同一目的序列的特定区域或是不同的锚定引物与同一随机引物组合扩增同一目的序列导致重复差异片段问题，进一步增加了工作量。

本发明的目的在于为充分利用cDNA文库所包含的丰富的cDNA信息，进行文库间的基因表达差异分析；为克隆低丰度和弱差异的表达基因信息，避免经典cDNA RDA方法不均衡消减杂交导致的信息量低和假阳性问题，以及mRNA DD方法存在的假阳性和巨大工作量问题，发明一种cDNA文库基础上cDNA消减杂交差异显示方法。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的。它利用cDNA文库所包含的丰富的cDNA信息，以大蒜的有效提取物大蒜素(Allitridi)处理和未处理的人胃癌细胞系BGC823细胞cDNA文库(Alli823cDNA文库和BGC823 cDNA文库)为样本，进行大蒜素处理前后人胃癌细胞系差异表达基因的克隆分析。结合文库载体自身所具有的酶切位点，选用限制性内切酶XhoI和BamHI双酶切选代表并行PCR扩增以制备两文库的扩增子，以两文库扩增子分别作为检测DNA和驱动DNA进行双向一轮消减杂交并降低杂交比例，而后以各自一轮消减杂交差异产物分别作为检测DNA和驱动DNA进行双向二轮消减杂交，两轮差异产物分别标记同位素α-³⁵S dATP后引入mRNA DD差异显示技术，并结合反向Northern印迹杂交进行差异片段筛选。这种方法是在两个cDNA文库间开展两轮双向消减杂交基础上引入差异显示技术，故命名为cDNA文库基础上cDNA消减杂交差异显示方法(Subtractive Hybridization Difference Display，SHDD)。

具体实施步骤：1.两个cDNA文库噬菌体DNA的制备：从大蒜素处理BGC823(简称Alli823)和BGC823亲本细胞cDNA文库中分别取1×10⁶克隆铺盘，提取两cDNA文库噬菌体DNA，各约40μg；2.两个cDNA文库噬菌体DNA扩增子(Amplicon，简称Amp)的制备：利用XhoI(10U/μl，Promega)对Alli823和BGC823文库DNA进行酶切，酶切体系70μl：文库DNA50μl(40μg)，10×缓冲液D(Buffer D)7μl，XhoI6μl，去离子水7μl；37℃4小时酶切反应。酶切产物经酚-氯仿-异戊醇抽提后，连接XhoI15，13接头(10μM)，连接反应的体积为120μl(模板与接头比例＝1∶10-30)：模板DNA 60μl(40μg)，XhoI15接头(10μM)15μl，XhoI13接头(10μM)15μl，10×T4连接酶Buffer 12μl，补去离子水至120μl；连接反应体系放置于50℃的温水烧杯中，1小时内从50℃逐步降至10℃，加T4连接酶(Biolab)400U，置16℃恒温水浴中20小时。连接后产物经BamHI(10U/μl，Promega)消化，酚-氯仿-异戊醇抽提后，再经QIAquick柱(QIAGEN)纯化，纯化后产物连接1RBam-12，24接头，连接反应体积、模板与接头比例及连接反应步骤同前。以连接产物为模板分别进行PCR扩增，反应体积为100μl(连接后产物1.5μl，2.5mM脱氧核糖核甘酸(dNTP)2μl，Taq DNA聚合酶(Taq DNA polymerase)10×buffer 10μl，50mM MgCl₂ 4μl，去离子水71.5μl)，PCR反应程序为72℃3分钟→分别加入Taq DNA聚合酶(Promega，5U/μl)1μl→72℃5分钟→分别加入1RBam24引物(10μM)10μl→(95℃1分钟+72℃3分钟)×25个循环→72℃10分钟，扩增产物即为由两文库DNA制备的各自的扩增子(Alli823 Amp，BGC823 Amp)，各需制备20μg；(SHDD方法扩增子制备原理图见附图1A)3.以两文库扩增子分别制备检测DNA(Tester DNA)和驱动DNA(Driver DNA)：两文库扩增子(各约20μg)分别经BamHI酶切去除接头并经QIAquick柱纯化，纯化后产物既为由两文库DNA制备的各自的驱动DNA；纯化后产物分别取1/10(各约2μg)连接第二套接头(2JBam12，24)，连接反应步骤同前，连接后产物既为两文库DNA各自的检测DNA；(步骤3-6的简要流程图见附图1B)4.检测DNA与驱动DNA的双向均衡一轮消减杂交：将1μg的检测DNA与20μg的驱动DNA混合(Tester∶Driver＝1∶20)，冷无水乙醇-20℃沉淀过夜，离心洗盐后溶于4μl3×EE Buffer，加入30μl高压灭菌石蜡油覆盖液面，95℃变性10分钟，再加入5M NaCl1μl，于恒温箱内67℃，杂交20小时。检测DNA与驱动DNA第一轮杂交后的扩增，扩增反应体积100μl(杂交后产物0.8μl，2.5mM dNTP2μl，10×Taq DNA Polymerase Buffer10μl，50mM MgCl₂4μl)，PCR反应程序为72℃3分钟→分别加入Taq DNA Polymerase 1μl→72℃5分钟→分别加入2JBam24引物(10μM)10μl→(95℃1分钟+70℃3分钟)×15个循环→72℃10分钟；PCR产物乙醇沉淀并洗盐后溶于30μl1×TE中。应用绿豆芽核酸酶(MBN)消化单链DNA，上述PCR产物中加2μl(Biolab，10U/μl)MBN，10×NE Buffer4μl，10×ZnSO₄ Buffer 4μl；30℃消化35分钟。消化后产物经酚-氯仿-异戊醇抽提，乙醇沉淀并洗盐后，溶于10μl去离子水中。消化单链DNA后的PCR扩增反应体积80μl：消化单链DNA并灭活MBN后模板2.5μl，dNTP(2.5M)2μl，2JBam24引物(10μM)8μl，Taq DNAPolymerase1μl，Taq DNA Polymerase Buffer(10×)8μl，补去离子水至80μl；反应条件：94℃3分钟→(94℃1分钟+70℃3分钟)×20个循环→72℃10分钟；扩增产物既为以两文库扩增子分别作为检测DNA获得的各自一轮消减杂交差异产物(DP1)；5.检测DNA与驱动DNA的双向均衡二轮消减杂交：两文库一轮消减杂交差异产物(DP1)经BamHI酶切去除2JBaml2，24接头并经QIAquick柱纯化，纯化后产物既为由两文库DP1制备的各自驱动DNA；纯化后产物分别取1/10(各约2μg)连接3Nbaml2，24接头，连接反应步骤同前，连接后产物既为由两文库DP1制备的各自的检测DNA。将0.1μg的检测DNA与20μg的驱动DNA混合(Tester∶Driver＝1∶200)，后续杂交反应、MBN消化单链DNA及PCR扩增制备两文库DNA各自二轮杂交差异产物(DP2)步骤同一轮杂交；6.一轮与二轮差异产物(DP1和DP2)的同位素标记及凝胶差异显示：以PCR法标记一轮与二轮差异产物，PCR反应体积20μl(模板10ng，2J/3NBam24(10μM)1.4μl，50mM MgCl₂ 0.8μl，25μMdC(GT)TP 1.5μl，25μM dATP1.2μl，Taq DNA Polymerase 0.4μl，TaqDNA Polymerase Buffer(10×)5μl，α-³⁵S-dATP(10μM)1.2μ，补去离子水至20μl)；PCR反应条件：94℃3分钟→(94℃2分钟，70℃10分钟)×2个循环。测序胶差异显示：同位素标记后PCR产物3μl加3μl终止反应液，80℃变性2分钟后上样行凝胶电泳，电泳结束后胶不固定，直接粘到Whatman 3M滤纸上，上覆保鲜膜，80℃真空干燥3小时抽干，去保鲜膜，三点打孔定位，压X光片。切胶：三点定位切取差异条带，0.1×TE 50μl浸泡过夜。取适量上清做模板进行PCR再扩增，反应体系50μl：切胶浸泡液3μl，2J/3NBam24(10μM)3μl，50mM MgCl₂ 1.5μl，2.5mM dNTP 1μl，Taq DNA Polymerase 0.4μl，Taq DNA Polymerase Buffer(10×)5μl，补去离子水至50μl；反应条件：94℃3分钟→(94℃1分钟，70℃3分钟)×30个循环→72℃10分钟，扩增产物既为应用SHDD方法获得的一轮与二轮差异片段；(测序胶差异显示及切胶回收片段再扩增结果见附图2A，2B)7.应用反向Northern印迹杂交对SHDD方法获得的一轮与二轮差异片段进行鉴定：分别取100ng差异片段PCR再扩增产物行1％琼脂糖凝胶电泳，应用盐桥转移法将片段DNA印迹转移至杂交膜；以构建Alli823 cDNA文库和BGC823 cDNA文库使用的双链cDNA做模板(各取100ng)，以随机引物法分别行α-³²P-dCTP标记；预杂交、杂交步骤同常规Northern印迹杂交；(反向Northern印迹杂交结果见附图3)8.反向Northern印迹杂交分析证实应用SHDD方法克隆得到10个经大蒜素诱导高表达的cDNA片段，其中7个已经测序证实分别来源于乙肝病毒X蛋白的抑制因子(XIP)，叶酸受体α(FRα)，钙结合蛋白(Calcyclin)，神经胶质细胞来源的踝蛋白(GDN)，组织蛋白酶D(Cathepsin D)，β-半乳糖甘酶保护蛋白(PPGB)，HADHA基因；获得6个大蒜素诱导低表达的cDNA片段，其中3个经测序证实来源于激活型G蛋白α亚单位(Gpalpl)，睾丸增强基因转录本/Bax抑制因子1(TEGT/BI-1)，人类interphotoreceptor基质蛋白多糖(IMPG2)基因；并同时获得经大蒜素诱导表达上调和下调的两个未知cDNA片段。本研究结果为阐释大蒜抗病毒、对抗多种人体肿瘤和心脑血管系统疾病的作用机制提供了有力的理论依据。获得了两条未知cDNA片段为进一步揭示大蒜有效成分预防疾病的生物学作用及分子机制奠定了基础。(测序及数据库同源性比较结果见表1)

表1.利用SHDD方法获得的差异表达cDNA片段

                                                        大蒜素诱导表达片段序号      cDNA          生物学功能 

                                                       上调    下调SH 2-3       Cathepsin D    溶酶体的标志性蛋白酶           +++++

                        蛋白降解、活化与抗原加工SH4-1        未知基因序列   与人类14号染色体仅             +++

                        19个碱基同源SH6-1        GDN            凝血酶抑制剂                   +

                        神经轴突延伸因子SH7-1        PPGB           β-半乳糖甘酶保护蛋白          ++SH8-2        HADHA          脂肪酸β-氧化                  +++SH9-1        XIP            抑制HBx转录激活活性            ++++

                        抑制HBV复制与增殖SH13-2       Gpalp1         活化cAMP信号通路                       +++

                        促进细胞增殖SH14-1       IMPG2          人类interphotoreceptor                 ++

                        基质蛋白多糖SH17-1       TEGT/BI-1      抑制细胞凋亡                           ++SH18-3       未知基因序列   含S2H2锌指结构                         ++

                        与果蝇Scrt基因部分同源DP3-1        FRα                        参与体内多种物质合成                   ++++DP3-2        Calcyclin      细胞周期相关蛋白               +++

                        参与钙离子信号传导通路SH1          ND                                            ++++SH3          ND                                            ++++SH10         ND                                            ++SH11         ND                                            +++SH16         ND                                                    ++++SH19         ND                                                    +++注：“+”代表基因表达水平上调或下调一倍；“ND”代表未测序。

本发明与现有技术相比，它的优点在于以下几个方面：为便于叙述，将两文库各自的mRNA信息群都划分为三种类型：优势信息；等同信息；弱势信息。对Alli823 cDNA文库而言，大蒜素诱导上调的信息为优势信息，诱导下调的信息为弱势信息；对BGC823cDNA文库而言，大蒜素诱导上调的信息为弱势信息，诱导下调的信息为优势信息，而大蒜素未影响的信息为两文库DNA的等同信息。

文库基础上cDNA消减杂交差异显示方法(SHDD)在充分利用cDNA文库提供的丰富的cDNA信息基础上，进一步结合了cDNARDA和mRNA DD两者的优点，同时又扩大了各自的优势并尽量避免了各自明显的缺点。1.利用cDNA文库提供的丰富的cDNA信息及文库载体提供的限制性内切酶酶切位点，将消减杂交差异显示方法建立在cDNA文库基础上，为已有的大量cDNA文库提供了新的应用前景。2.与cDNA RDA比较，SHDD存在以下优势：(1)cDNA RDA方法以识别4个碱基位点的限制性内切酶酶切选代表(平均1个切点/256个碱基对(bp))，双链cDNA(平均2千个碱基对(kb))平均可切出7-8条片段，差异片段普遍偏短，特异性较低，而且存在数条差异片段来源于同一目的序列的结果重复问题；而SHDD结合了两个cDNA文库载体自身所具有的酶切位点，利用XhoI和BamHI双酶切选代表(平均1个切点/2kb)，这样在保证扩增子信息量的同时又可获得较长差异片段，有利于提高后续Northern印迹杂交、序列同源性比较以及文库筛选的特异性；(2)cDNA RDA方法需进行三轮乃至四轮消减杂交才可获得明显的差异片段，较高的消减杂交比例以及每轮杂交后的多轮PCR扩增导致驱动DNA、一轮差异产物、二轮差异产物的片段群分布趋势依次递减，在二轮和三轮消减杂交中就存在了驱动DNA与一轮和二轮差异产物片段群间的不均衡消减杂交问题，驱动DNA与一轮和二轮差异产物的重叠区，也即差异产物片段群的偏长区域遭受较高消减杂交比例的抽提而发生信息量丢失，差异产物片段群的偏短区域在驱动 DNA中仅有很少的对应序列，遭受的抽提效果较弱从而作为假阳性信息出现；而SHDD方法则是在两样本间开展了双向一轮消减杂交和各自一轮差异产物间的双向均衡二轮消减杂交，从而避免了不均衡消减所导致的信息量丢失与假阳性问题；(3)双向一轮消减杂交突出了两样本各自的信息差异，而均衡二轮消减杂交又进一步放大该信息差异，高分辨率同位素差异显示技术的引入又替代了cDNA RDA溴乙锭显带的方法，因而可以只采用两轮消减杂交并降低消减杂交比例，有利于差减得到较低丰度和较弱的差异信息；(4)文库载体自身序列酶切后出现分别约22kb、11kb、6kb和850bp的四条明显带型，前三条序列较大，不会与目的序列选出的代表发生竞争性PCR扩增但可以作为内切酶消化适度的指标，从而提高了两样本扩增子之间的可比性；(5)载体序列来源的850bp片段代表两文库扩增子最高拷贝数的等同信息，可作为消减杂交抽提效果的评估依据。3.与mRNA DD相比，SHDD也具有着明显优势：(1)mRNA DD由于随机引物和锚定引物与目的序列的非特异性结合及其他原因使得假阳性结果占有较高的比例，而且由于不同的随机引物结合到同一目的序列的特定区域或是不同的锚定引物与同一随机引物组合扩增同一目的序列导致重复差异片段问题；而SHDD的差异显示采用了24个碱基长的高度特异性引物，有效地解决了上述问题并有利于低丰度信息的扩增；(2)mRNA DD由于自身设计上存在的问题导致差异结果中同一条带的位置可能包含几种不同的信息，进一步分离鉴定这些信息已成为mRNA DD最为耗时、耗力的步骤；而SHDD方法通过双向均衡两轮消减杂交突出了两样本各自的优势信息、等同信息均衡减弱、弱势信息显著压制，这在提高差异分析结果特异性的同时允许将两样本总mRNA间的差异信息集中在一板测序胶上进行差异显示分析，从而极大地简化了mRNA DD多种随机引物与锚定引物组合、多次测序胶电泳分析及后续复杂的筛查工作；(3)载体序列来源的850bp片段由于代表了两文库扩增子最高拷贝数的等同信息，经过两轮温和消减杂交抽提后仍可能存在于各自二轮差异产物中，这就为后续差异显示分析提供了天然内对照，提高了实验的可重复性。

SHDD方法建立在cDNA文库基础上，并进一步结合了cDNA RDA的特异性特点与mRNA DD在双向筛查差异片段和较高的同位素检测灵敏度方面的优势。在具体技术路线设计上，SHDD的特点就是在两cDNA文库样本间双向一轮与二轮均衡、温和消减杂交基础上引入了同位素mRNA DD差异显示技术，使得该方法在克隆低丰度及弱差异信息，提高差异分析结果的特异性减少假阳性，减少重复差异结果，提高差异分析的信息量同时又降低工作量等方面明显优于经典的mRNA DD和cDNA RDA方法，为克隆低丰度弱差异的基因提供了有效的手段；并同时为cDNA文库提供了新的应用前景。(见表2)

表2.SHDD与cDNA RDA，mRNA DD方法优缺点对比

            特异性            差异片段数量         工作量cDNA RDA        +++                    ++                ++mRNA DD          +                    ++++              +++++SHDD            +++                   ++++               ++

下面结合附图和实施例对本发明做进一步细述。

附图1A为cDNA文库基础上cDNA消减杂交差异显示方法(SHDD)扩增子的制备。其中：λZAPII为cDNA文库构建使用的噬菌体载体；黑框代表文库载体序列，白框代表插入序列；Bam/B代表限制性内切酶BamHI，Xho/X代表限制性内切酶XhoI；XhoI接头内包含BamHI切点GGATCC。

附图1B为cDNA文库基础上cDNA消减杂交差异显示方法(SHDD)的简要流程图。其中：Alli Amp为由Alli823文库DNA制备的扩增子，BGC Amp为由BGC823文库DNA制备的扩增子；T代表检测DNA(Tester DNA)，D代表检测DNA(Driver DNA)；Alli DP1代表以Alli823扩增子作为检测DNA获得的一轮消减杂交差异产物，BGC DP1代表以BGC823扩增子作为检测DNA获得的一轮消减杂交差异产物；1st SH代表一轮消减杂交，2nd SH代表二轮消减杂交。

附图2A为应用SHDD方法获得的一轮及二轮差异产物(DP1和DP2)经同位素α-³⁵S-dATP标记后测序胶差异显示的结果。其中：AlliDP1代表以Alli823扩增子作为检测DNA获得的一轮消减杂交差异产物，BGC DP1代表以BGC823扩增子作为检测DNA获得的一轮消减杂交差异产物。

附图2B为应用SHDD方法获得的一轮及二轮差异片段。

附图3为应用SHDD方法获得的一轮及二轮差异片段的反向Northern印迹杂交结果。其中(A)A-K分别代表差异片段SH1，2，3，21，4，5，6，22，9，8，7。除片段SH 21(D)外，其余片段经大蒜素(Allitridi)处理后表达水平均见上调。(B)A-L分别代表差异片段SH 13，8，14，15，23，16，24，17，18，20，19，25。其中片段SH13，14，15，16，17，18，19经大蒜素处理后表达水平下调。GAPDH被用作反向Northern印迹杂交对照(Con)。探针(Probe)Alli823为由大蒜素处理后BGC823细胞mRNA逆转录置换合成的双链cDNA(ds-cDNA)；探针(Probe)BGC823为由亲本BGC823细胞mRNA逆转录置换合成的双链cDNA(ds-cDNA)。

实现发明的最佳实施例：

1.选择两个可比性强的cDNA文库(如药物处理与未处理细胞cDNA文库或某一脏器肿瘤组织与正常组织细胞cDNA文库)作为基因表达差异分析对象：如研究中采用的大蒜素处理与未处理BGC823细胞cDNA文库；

2.选择单一限制性内切酶或两种内切酶联合应用对文库DNA进行酶切选代表，内切酶酶切应保证选出代表的信息量，并同时注意内切酶不应将载体(噬菌体)DNA切出小于800bp的短片段，尽量避免载体DNA与插入序列的后续PCR竞争性扩增；本研究采用BamHI和XhoI双酶切选代表，文库载体自身序列酶切后出现分别约22kb、11kb、6kb和850bp的四条明显带型，前三条序列较大，不会与目的序列选出的代表发生竞争性PCR扩增但可以作为内切酶消化适度的指标；

3.不同的cDNA文库样本，差异表达基因的种类、丰度以及表达水平差异的程度不同，因而需根据具体的情况选择一轮与二轮的消减杂交比例，以尽量克隆得到低丰度、弱差异表达的基因，增加差异分析结果的信息量；本研究采用一轮消减杂交比例检测DNA∶驱动DNA＝1∶20，二轮消减杂交比例检测DNA∶驱动DNA＝1∶200；

4.两样本各自一轮差异产物之间及各自二轮差异产物之间应具有较好的可比性，PCR扩增的程度以测序胶差异显示观察到较多清晰的差异条带为宜，扩增循环数过少差异信息不能获得足够程度的富集，扩增循环数过多则会导致低丰度差异信息的丢失；而且选择不同的限制性内切酶酶切选出的代表扩增趋势不一致，因而需调整PCR扩增循环数以获得最佳差异分析结果；本研究采用的PCR扩增循环数为20个循环；

5.两轮差异产物应在调整好产物片段群趋势可比性的基础上，应用1-2个循环的PCR扩增分别标记同位素α-³⁵S dATP；模板DNA以10ng为宜，经过2个循环的PCR扩增可获得40ng的产物，据此计算α-³⁵S dATP与其他四种dNTP的用量(摩尔数)比例，以α-³⁵SdATP∶dNTP＝1∶30为宜；适当降低无同位素标记的dATP的用量，以在确保扩增片段完整性的基础上增加α-³⁵S dATP的掺入率。