黄萎病菌诱导下海岛棉cDNA文库构建和抗病相关基因克隆

摘要

黄萎病(Verticillium wilt)是影响世界棉花生产的主要病害之一。育种实践证明，培育抗病品种是控制棉花黄萎病的经济有效途径。研究证明海岛棉Pima90-53对黄萎病具有高度抗性;对其抗黄萎病相关基因进行克隆研究不仅有利于阐明品种抗病机制，而且对棉花抗黄萎病的分子育种具有重要价值。本研究以海岛棉Pima90-53为材料，构建其在黄萎病菌诱导下的根系cDNA文库，并依据文库克隆棉花抗黄萎病相关基因。主要结果如下:
　　 1.构建了黄萎病菌诱导下的海岛棉Pima90-53根系的全长cDNA文库
　　 采用SMART技术成功构建了黄萎病菌诱导下的Pima90-53根系全长cDNA文库，该文库基础库容量为1.28×106 PFU，重组率94％，扩增后文库滴度大于1010 PFU·mL-1，插入片段平均长度1.1kb。经随机测序共获得45条cDNA序列，利用Blastx程序进行同源分析，4个contigs与假定抗病相关基因同源性较高;3个contigs没有注释，可能为新基因。
　　 2.利用文库筛选和RACE技术相结合，克隆了一个新的GbWRKY1基因
　　 利用构建的cDNA文库，结合RACE技术，获得了一个新WRKY基因（GbWRKY1）(GenBank No.JF831361)。Gb WRKY1基因cDNA全长1971bp，包括5'端非编码区271bp，3'端非编码区230bp，含有1个可能的polyA加尾信号:AATAAT;基因开放阅读框为1470bp，编码一个由489个氨基酸构成的多肽。
　　 生物信息学分析发现GbWRKY1包括2高度保守的WRKY基本结构域和锌指结构，属于WRKY家族第Ⅰ类，与VvWRKY2、AtWRKY4和AtWRKY3蛋白的同源性分别为62％、61％和59％; GbWRKY1属可溶性蛋白，无信号肽和跨膜结构域，包含N-糖基化位点、蛋白激酶C磷酸化位点、N端肉豆蔻酰化位点、酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点、依赖cAMP和cGMP蛋白激酶磷酸化位点等。
　　 Gb WRKY1基因含有3个内含子，具有有保守的GT-AG剪切位点，分别为599 bp、81 bp、325 bp。克隆得到GbWRKY1的1762bp启动子，包含植物病原诱导性启动子调控元件(RAV1AAT、Box-W1、ARE、W-box、CGTCA-motif、ERE、TGACG-motif)与非生物胁迫应答元件(HSE、 TC-rich repeats、WRKY71OS、WBOXNTERF3、MYCATERD1)。
　　 构建了基因融合表达载体pCamE-GbWRKY1-GFP，基因枪转化洋葱内表皮细胞，结果显示转化pCamE-GbWRKY1-GFP表皮细胞的细胞核出现绿色荧光，GbWRKY1蛋白定位于细胞核。
　　 3.Northern杂交分析了GbWRKY1在黄萎病菌接种后的表达模式，揭示了基因与棉花抗黄萎病的联系;实时定量PCR分析了GbWRKY1在不同激素处理下的表达模式，为解析基因作用机制提供了依据;构建了Gb WRKY1超表达与RNAi载体，获得了转基因T3拟南芥
　　 Northern杂交分析Gb WRKY1表达模式发现，基因在Pima90-53的根、茎和叶组织均有表达;在受黄萎病菌、SA、MeJA和ACC的诱导后呈现不同的表达模式。在黄萎病菌诱导后，Gb WRKY1基因在接种后出现持续高表达，在8h出现表达高峰，并持续高表达至接菌后12h。SA诱导后，其表达量在12h降到最低，24h基本恢复正常水平;MeJA诱导后，Gb WRKY1表达量上升，在12h达到高峰，24h出现下降;ACC诱导12h，Gb WRKY1表达呈现明显上升，并持续到24 h。
　　 构建了Gb WRKY1基因超表达和反义载体pCamE-GbWRKY1、pCamE-iGbWRKY1，通过农杆菌介导法转化拟南芥，经潮霉素筛选和PCR检测，获得了Gb WRKY1过表达转基因T3拟南芥。

目录

声明

摘要

本文所用英文缩略词及中文对照

1 引言

2 材料与方法

2．1 试验材料

2．1．1 供试材料

2．1．2 实验试剂

2．2 试验方法

2．2．1 PDA、查彼克、MS培养基和Hogland营养液及主要试剂的配制

2．2．2 强致病力黄萎病菌T5悬浮液的准备

2．2．3 棉花苗期无杂菌定量黄萎病抗性鉴定方法及植物材料获得

2．2．4 棉花根系总RNA提取

2．2．5 棉花根系总RNA中基因组的去除

2．2．6 根系总RNA中mRNA分离

2．2．7 cDNA文库构建与分析

2．2．8 文库的保存

2．2．9 文库的筛选

2．2．10 GbWRKY1基因3＇端和5＇端的扩增验证

2．2．11 目的基因的生物信息学分析

2．2．12 GbWRKY1基因的洋葱表皮细胞定位

2．2．13 棉花基因组DNA的提取及目的基因全长扩增

2．2．14 目的基因的启动子扩增

2．2．15 GbWRKY1基因表达模式分析

2．2．16 GbWRKY1基因植物表达载体的构建

2．2．17 真核表达载体的农杆菌转化

2．2．18 农杆菌转化拟南芥

2．2．19 拟南芥阳性植株筛选与鉴定

2．2．20 GbWRKY1转基因拟南芥抗病性鉴定

3 结果与分析

3．1 棉花苗期无杂菌定量黄萎病抗性鉴定方法的建立

3．1．1 种子的消毒方法和培养基筛选结果

3．1．2 不同接菌方法接菌后菌丝分离结果

3．1．3 无菌苗蘸根接种黄萎病菌后抗性鉴定

3．2 接菌后海岛棉根系总RNA及mRNA获得

3．3 cDNA文库的构建及质量鉴定

3．3．1 双链cDNA的合成、鉴定及cDNA的分级分离

3．3．2 原始文库的滴度及重组率测定测定

3．3．3 原始文库插入片段长度的测定

3．3．4 扩增文库滴度的测定

3．3．5 EST的同源序列比较与功能注释分析

3．4 GbWRKY1基因cDNA克隆

3．4．1 cDNA文库的筛选

3．4．2 目的基因5＇端和3＇端序列克隆

3．4．3 GbWRKY1的生物信息学分析

3．5 GbWRKY1的基因组序列分析

3．6 GbWRKY1基因的启动子分析

3．7 GbWRKY1基因的亚细胞定位

3．7．1 目的片段的扩增及测序

3．7．2 目的基因和表达载体的连接

3．7．3 亚细胞定位

3．8 GbWRKY1的表达特异性分析

3．8．1 GbWRKY1组织表达特异性

3．8．2 黄萎病菌诱导下GbWRKY1表达分析

3．8．3 植物激素对GbWRKY1内源表达的影响

3．9 GbWRKY1植物超表达和反义载体构建

3．9．1 GbWRKY1编码区的克隆

3．9．2 pCamE-GbWRKY1表达载体的构建

3．10 转基因拟南芥抗抗生素筛选和分子验证

3．10．1 转基因拟南芥抗生素筛选

3．10．2 转化植株的PCR检测

3．10．3 转基因拟南芥植株转录水平分析

3．11 转基因拟南芥抗病性鉴定

3．11．1 GbWRKY1转基因拟南芥黄萎病抗性鉴定

3．11．2 GbWRKY1转基因拟南芥体外抑菌鉴定

4 讨论

4．1 关于棉花苗期无杂菌定量黄萎病抗性鉴定方法

4．2 关于黄萎病菌诱导下的Pima90-53根系cDNA文库

4．3 关于海岛棉GbWRKY1

4．4 关于海岛棉GbWRKY1在信号途径中的作用

5 结论

参考文献

附录Ⅰ 试验所用试剂配方

附录Ⅱ RACE原理示意图

附录Ⅲ 试验中所用载体结构示意图

在读期间发表论文情况

作者简历

致谢