黄萎病菌诱导下海岛棉全长cDNA文库分析及功能基因克隆

摘要

本研究以课题组前期创建的黄萎病菌诱导下海岛棉全长cDNA文库为基础，对得到的EST序列，利用COG、KOG、KEGG和GO进行功能注释和代谢途径聚类分析，对本文库进行筛选分析，筛选抗黄萎病相关基因，为棉花抗黄萎病研究增加新的基因资源，为棉花抗黄萎病育种奠定基础。
　　经过生物信息学、时空特异性表达分析，筛选出与抗黄萎病相关的基因GbCRK、GbVPE，并克隆基因的开放阅读框序列;构建GbCRK、GbVPE真核过表达载体并转化拟南芥;构建病毒介导的基因沉默载体转化棉花，研究基因抗黄萎病作用。获得主要结果如下:
　　1.对本文库进行的分析结果显示，得到高质量EST序列46192条，经拼接得到23126个unigene，平均长度为818bp。能与NR、SWISS-PROT、TREMBL、CDD、PFAM数据库有最佳匹配的基因分别占到总EST序列的78.07％、59.71％、78.43％、57.88％、80.24％。并且发现3027个其它作物已知抗病基因，4936个转录因子，680个海岛棉特有的新基因。通过功能注释发现，共有12248个基因注释到COG中，发现了289个与抗黄萎病相关的途径，还发现至少有一个GO注释的达到20397个，其中注释为生物过程（Biological Process）的有6893个;注释为细胞组分(Cellular Component)的有11305个;注释为分子功能(Molecular Function)的有8383个;全部含有这三个功能注释的有6184个基因。
　　2.GbCRK的ORF大小为1944 bp，编码647个氨基酸组成的多肽，具有S-TK保守序列。荧光定量PCR结果显示，在三个不同抗、感品种中，GbCRK在感病品种“邯208”中表达水平最高，耐病品种“农大棉8号”次之，抗病品种“Pima90-53”表达水平最低。三个品种在被黄萎病菌侵染后，GbCRK均短暂快速上升，接着短时间内有所下降，最后保持在较高水平的表达，据此推测GbCRK在黄萎病菌侵染植株的应答反应中具有一定作用。
　　3.GbVPE的ORF大小为1467bp，编码488个氨基酸构成的多肽，具有C13保守序列，属于C13家族。荧光定量PCR结果显示，在感病品种“邯208”中表达水平最高。黄萎病菌侵染后，Gb VPE在三个品种中表达均呈先下降后上升最后稳定保持在较高的表达水平上，彼此间只是到达的时间及峰值不同。推测Gb VPE与抗黄萎病互作的进程相关。
　　4.分别构建了植物真核过表达载体pCAM-GbCRK、pCAM-GbVPE，并转化拟南芥，经卡那霉素筛选和PCR分子检测，收获了拟南芥的转基因纯合株系。
　　5.构建完成了VIGS载体pTRV2-GbCRK、pTRV2-Gb VPE，验证了基因沉默效果并成功获得基因沉默植株。

目录

声明

摘要

本文所用英文缩略词及中文对照

1 引言

1．1 我国棉花黄萎病危害现状

1．2 植物抗病机制

1．3 全长cDNA文库的应用

1．4 病毒诱导的基因沉默(VIGS)在棉花中的应用

1．5 抗病相关基因在棉花基因工程中的应用

1．6 本研究的目的和意义

2 材料与方法

2．1 试验材料

2．1．1 供试材料

2．1．2 菌种

2．1．3 试验试剂

2．2 试验方法

2．2．1 cDNA文库数据处理与生物信息学分析

2．2．2 棉苗培育及接菌处理

2．2．3 棉花根系总RNA提取

2．2．4 实时荧光定量PCR表达分析

2．2．5 目的基因全长ORF克隆

2．2．6 基因真核超表达载体的构建

2．2．7 真核表达载体的农杆菌转化

2．2．8 Floral dip法转化拟南芥

2．2．9 拟南芥阳性植株筛选和分子检测

2．2．10 VIGS载体的构建

2．2．11 农杆菌介导的VIGS棉花的转化

2．2．12 棉花基因沉默效果鉴定

3 结果与分析

3．1 cDNA文库数据处理与生物信息学分析

3．1．1 与公共数据库比对

3．1．2 COG功能分类

3．1．3 KEGG分析(信号通路分析)

3．1．4 GO(Gene ontology)注释

3．1．5 高丰度表达基因

3．1．6 转录因子(transcription and factors)分析

3．1．7 不同基因在黄萎病菌诱导后的表达分析

3．2 GbCRK、GbVPE不同品种时空特异性表达

3．2．1 黄萎病菌分离试验

3．2．2 棉花总RNA的提取与cDNA的合成

3．3 黄萎病菌胁迫下不用关键基因在棉花不同抗、耐品种中的表达分析

3．3．1 GbCRK在不同抗感病品种中的差异表达

3．3．2 GbVPE在不同抗感病品种中的差异表达

3．4 基因克隆及生物信息学分析

3．4．1 基因克隆及序列分析

3．4．2 GbCRK的生物信息学分析

3．4．3 GbVPE的生物信息学分析

3．5 真核超表达载体的构建

3．5．1 目的片段的扩增及测序

3．5．2 目的基因和表达载体的连接

3．6 转基因拟南芥阳性植株的筛选和分子检测

3．6．1 转基因拟南芥阳性植株的筛选

3．6．2 转基因拟南芥阳性植株的PCR检测

3．7 GbCRK GbVPE在棉花中的功能验证

3．7．1 GbCRK GbVPE的VIGS载体构建

3．7．2 VIGS沉默棉花GbCLA1基因验证

3．7．3 VIGS沉默棉花基因验证

4 讨论

4．1 关于cDNA文库分析

4．2 关于GbCRK基因功能预测

4．3 关于GbVPE的表达分析

5 结论

参考文献

附录

在读期间发表的论文

作者简历

致谢

黄萎病菌诱导海岛棉全长cDNA文库构建及EST分析