产CLA植物乳杆菌诱变后LAI基因mRNA差异性分析

摘要

共轭亚油酸（Conjugated linoleic acid，CLA）是一种不饱和脂肪酸，具有抗癌，抗氧化、抗动脉粥样硬化、增强免疫力、提高骨骼密度、防治糖尿病、降低胆固醇、促进生长发育等生理功能。CLA主要来源于反刍动物食品，但牛乳中的CLA水平相当低。添加化学合成的CLA可以提高乳中CLA含量，但是副产物难以处理，甚至有些化学原料会有一定的毒性。自然界许多微生物能够利用自身的酶将亚油酸（linoleic acid，LA）转化成 CLA。目前，人们将获得 CLA的注意力更多地转向了可食用的微生物，植物乳杆菌就是其中的一种。
　　本研究从实验室保藏的植物乳杆菌P8出发，利用N+离子束诱变技术对其进行诱变处理，筛选出CLA产量下降的负突变菌株，进行50代的稳定遗传。克隆野生型菌株亚油酸异构酶基因，构建质粒标准品，用实时荧光定量PCR检测负突变菌株和野生型菌株LAI基因mRNA表达的差异性。为探索产生CLA的分子基础提供理论依据，也为大力开发我区乳酸菌资源生产富含CLA保健乳提供技术支撑。
　　研究结果表明:
　　（1）在真空度为10-3Pa，能量为15-20keV，束流为15mA，采用脉冲方式，离子束注入剂量为30~190×2.6×1013N+/cm29个梯度分别处理样品，得到“马鞍型”存活曲线。
　　（2）诱变处理后每个处理随机挑取30个菌，得到正突变菌株共36株，负突变菌株共66株，其中最高产 CLA正突变菌株和最低产 CLA负突变株产 CLA浓度分别为0.2751mg/mL和0.0330mg/mL，转化率为27.51％和3.30%。
　　（3）负突变菌株进行50次的传代后，有5株负突变菌株遗传稳定性良好。
　　（4）稳定遗传的5株负突变菌株与野生型菌株之间的起始拷贝数差异显著，(p<0.05)，其中9-6，9-7，9-25，9-26，4株负突变菌株的起始拷贝数显著低于野生型菌株(p<0.05)，9-8的起始拷贝数显著高于野生型菌株(p<0.05)。5株负突变菌株的起始拷贝数之间差异也显著，初步表明mRNA表达水平对CLA的产量有影响。

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插图和附表清单

1 引 言

1.1 共轭亚油酸简介

1.2 亚油酸异构酶的简介

1.3 共轭亚油酸的检测方法

1.4 诱变技术的简介

1.5 核酸的定量分析法

1.6 实时荧光定量PCR技术简介

1.7 选题依据

1.8 研究内容

1.9 研究的技术路线

2. 试验材料与方法

2.1 仪器与试剂

2.2 试验方法

3 结果与分析

3.1 植物乳杆菌N+离子束诱变

3.2 质粒标准品的制备

3.3 菌株总RNA的提取结果

3.4 反转录结果

3.5 实时荧光定量PCR

3.6 结论

4 讨论

5 主要创新点

致谢

参考文献

附录

作 者 简 介