植物乳杆菌HE-1在共培养中产抑菌物质与LuxS/AI-2群体感应现象关系的研究

摘要

本研究使用的乳酸菌菌种均分离自内蒙古锡盟地区的酸马奶酒中，第一，使用Spot-on-lawn法在固体培养基上对具有产生抑菌物质潜力的Lactobacillus plantarumHE-1和Enterococcus faecium HE-432进行筛选，同时筛选出用于后续检测试验的最佳指示菌;第二，选用相近或不同种属乳酸菌作为环境中的刺激因素，设计14个共培养组合，使用打孔法检测混菌培养上清液的抑菌性;第三，对于具有抑菌性的混菌培养上清液进行AI-2信号分子检测，寻找AI-2信号分子产生与发酵产生抑菌物质二者之间在时间和产生量上的对应关系;第四，对产抑菌物质乳酸菌生物膜生成和群体感应现象二者关系进行探索，为以后将其开发为肠道益生菌打下基础;第五，使用分子生物学手段验证产抑菌物质乳酸菌含有luxS基因片段，辅助证明AI-2信号分子的产生。实验结果显示，第一，L.plantarum HE-1产生的抑菌物质对肠球菌、发酵乳杆菌、植物乳杆菌、乳酸乳球菌、乳酸片球菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌和藤黄微球菌均有不同程度的抑制作用，并选取抑制作用最好的大肠杆菌作为后续实验的指示菌。第二，在15个共培养组合诱导产抑菌物质实验中， L.plantarum HE-1与11个组合产生的抑菌物质可以抑制指示菌生长，其中与E faecium HE-521的共培养组合产生的抑菌圈最大达到17.84mm;L.plantarumHE-1与肠球菌、发酵乳杆菌、植物乳杆菌、乳酸乳球菌、乳酸片球菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌共培养均可以诱导产出抑菌物质;11个共培养组合诱导产生抑菌物质的时间有10个发生在9h，其中L.plantarum HE-1单菌液体培养不产生抑菌物质。第三，4个共培养可以诱导抑菌物质产生的组合均于9h处产生AI-2信号分子，并在6h到15h范围内形成一个小峰，且9h处AI-2信号分子的相对荧光强度均大于L.plantarum HE-1单独培养时在9h处产生的AI-2信号分子量。从抑菌物质和AI-2信号分子产生的时间与数量的对应关系上看，其二者存在相关关系。第四，L.plantarum HE-1的生物膜生成时间和生成量与AI-2信号分子的产生时间和产生量非常吻合，luxS基因成功扩增，同源性分析显示L.plantarum HE-1与已知植物乳杆菌luxS基因同源性高达99％以上。分析实验结果得出L.plantarum HE-1生物膜生成与AI-2/LuxS群体感应系统二者之间有密切的关系，并且luxS基因的扩增成功和同源性分析从分子生物学上验证了L.plantarum HE-1具有产生AI-2信号分子的关键基因。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 乳酸菌抑菌特性概述

1．1．1 乳酸菌素Nisin的研究概述

1．1．2 乳酸菌Ⅱ类细菌素的研究概述

1．2 群体感应现象概述

1．2．1 种内群体感应系统概述

1．2．2 由LuxS／AI-2介导的种间群体感应系统概述

1．3 基于LuxS／AI-2的群体感应系统在乳酸菌共培养中的研究进展概述

1．3．1 乳酸菌种间共培养中LuxS／AI-2系统调控的QS现象

1．3．2 乳酸菌与其他种属菌株或细胞共培养中LuxS／AI-2系统调控的QS现象

1．4 微生物生物膜生成与LuxS／AI-2的群体感应系统二者之间的关系

1．5 研究的目的及意义

2 材料与方法

2．1 仪器与材料

2．1．1 实验菌种

2．1．2 仪器

2．1．3 药品试剂

2．2 实验方法

2．2．1 菌种保藏、活化和计数

2．2．2 Spot-on-lawn抑菌物质检测法

2．2．3 乳酸菌共培养方法

2．2．4 发酵上清液的制备

2．2．5 打孔法检测混菌培养上清液抑菌物质

2．2．6 AI-2信号分子的检测及方法优化

2．2．7 生物膜形成的检测

2．2．8 DNA的提取与luxS基因的扩增

2．2．9 同源性分析与系统发育树的构建

3 结果与分析

3．1 Spot-on-lawn法筛选产抑菌物质实验菌和最佳指示菌

3．2 共培养中产抑菌物质与AI-2信号分子产生二者的相关关系

3．2．1 共培养诱导产生抑菌物质

3．2．2 共培养中AI-2信号分子的检测

3．2．3 共培养中AI-2信号分子的产生与产抑菌物质二者的相关关系

3．3 L．plantarum HE-1生物膜形成与AI-2信号分子产生二者的相关关系

3．4 luxS的扩增及同源性和系统发育分析

4 讨论

4．1 Spot-on-lawn法筛选产抑菌物质实验菌和最佳指示菌

4．2 共培养中产抑菌物质与AI-2信号分子产生二者的相关关系

4．2．1 共培养诱导产生抑菌物质

4．2．2 共培养中AI-2信号分子的检测

4．2．3 共培养中AI-2信号分子的产生与产抑菌物质二者的相关关系

4．3 L．plantarum HE-1生物膜形成与AI-2信号分子产生二者的相关关系

4．4 luxS的扩增及同源性和系统发育分析

5 结论

致谢

参考文献

附录

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