人羊膜间充质干细胞定位修复四氯化碳诱导小鼠肝损伤的研究

摘要

肝脏是人体内功能最多的代谢和解毒器官，具有多种生理功能参与体内消化、代谢、解毒和免疫等过程，因此，肝脏损伤可引起动物和人体的衰老病变和其他疾病的发生。目前，严重的肝脏疾病目前还没有找到一种完全能治愈的措施和治疗方法。由于干细胞具有自我更新和多向分化潜能，有望为干细胞移植性治疗提供新来源，是病变组织器官损伤修复的理想首选细胞。近几年研究者们主要将目光集中在胎盘来源的羊膜组织上，不仅其获得取材方便、来源广泛、增殖能力强、免疫原性低，最重要是不受医学伦理道德限制的优点，这也是比胚胎干细胞应用更广泛的主要原因。羊膜包含两种细胞即人羊膜间充质干细胞和羊膜上皮细胞，其中人羊膜间充质干细胞(human amnion mesenchymal cells,hAMSCs)起源中胚层属于成体干细胞，具备间充质干细胞特性同时还具有胚胎干细胞特性，此外hAMSCs还具有在体外特定条件下向内、中、外三个胚层分化潜能，是干细胞移植和再生医学的种子细胞。
　　1、经过胰蛋白酶和Ⅰ型胶原酶共同消化羊膜组织获得hAMSCs，培养并观察细胞生长特性、形态特征、解析分裂中期的染色体；再通过免疫细胞化学、二氨基联苯胺（Diaminobenzidine Staining，DAB）染色、免疫荧光染色、流式细胞术分析表面抗原、定向诱导三胚层分化和RT-PCR检测等方法对培养的细胞进行鉴定。试验结果表明，从人羊膜组织中分离得到纯度很高的间充质干细胞，经过免疫组化波形丝蛋白（vimentin）DAB染色呈现浅红色阳性表达；免疫荧光检测表达间充质干细胞表面标记 Vimentin和胚胎干细胞表面标记SSEA-4；流式细胞术测定细胞强阳性表达间质细胞表面抗原CD29、CD49d、CD73，不表达造血干细胞表面抗原CD34、CD45和人白细胞免疫抑制因子HLA-DR；经过免疫细胞化学RT-PCR检测在体外特定条件下可成功诱导分化为脂肪细胞、成骨细胞、神经样细胞和胰岛样细胞。结果表明hAMSCs可在体外成功分离、纯化、增殖培养并保持稳定的遗传和生物特性，还具有体外三胚层分化潜能。
　　2、以四氯化碳（CCL4）诱导小鼠肝损伤为受试模型，将活体染料Dir和羧基荧光素乙酰乙酸（CFSE）标记的hAMSCs通过尾静脉注射移植到肝损伤小鼠，观察hAMSCs在小鼠体内迁移归巢情况及移植后治疗效果。结果表明成功建立小鼠肝损伤模型，Dir和CFSE标记hAMSCs分别通过活体成像和冰冻切片免疫荧光观察移植hAMSCs可以迁移归巢到受损的肝脏，hAMSCs移植后对受损小鼠肝功、组织病理学以及分泌白蛋白等方面都有修复作用，肝损伤程度明显改善，治疗效果显著。
　　3、实时荧光定量和蛋白印迹技术检测表明hAMSCs移植后可提高受损肝组织中肝细胞生长因子（HGF）和沉默信息调节因子1（SIRT-1）的表达，抑制α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）和周期性蛋白依赖性激酶抑制因子（P27kip1）的表达，这些基因参与调控肝细胞增殖、再生，细胞凋亡等方面，抑制肝纤维化过程，因此，α-SMA、HGF、SIRT-1、P27kip1可能是肝再生过程中关键基因，且hAMSCs移植后改善CCL4诱导的肝纤维化，抑制细胞凋亡，促进肝细胞有丝分裂，对肝损伤有一定的修复作用，为进一步探索调控肝再生、损伤修复信号通路（机制）及预防肝纤维化提供了新的启示。
　　综上，hAMSCs可在体外分离培养且具有三胚层分化潜能；经过标记的hAMSCs能够迁移归巢到受损肝脏组织，并能通过参与调控肝细胞相关基因对肝损伤有一定的修复作用，为治疗肝损伤疾病等方面提供实验数据和临床依据。

目录

声明

缩 略 语 表

1引言

1.1人羊膜间充质干细胞研究现状

1.2干细胞治疗肝脏疾病研究进展

1.3本研究的目的和意义

1.4技术路线

2 实验一 人羊膜间充质干细胞体外分离培养及诱导分化

2.1材料与方法

2.2实验结果

2.3讨论

2.4小结

3 实验二 人羊膜间充质干细胞定位修复小鼠肝损伤模型

3.1 材料与方法

3.2 实验结果

3.3讨论

3.4小结

4 实验三 人羊膜间充质干细胞移植促进肝损伤修复的作用与机制

4.1材料与方法

4.2实验结果

4.3讨论

4.4小结

5 结论

致谢

参考文献

作 者 简 介