转基因产品快速检测技术的研究

摘要

随着转基因技术的快速发展,转基因作物的种类和数量也急剧增加。由于越来越多的外源插入元件被转入的作物中,直接检测某种插入元件或特异性转化事件变得费时、费力并且成本较高。所以国外许多转基因产品检测机构逐步建立转基因产品的快速筛选技术,并与矩阵方法相结合大大提高了转基因产品的检测效率,这种快速筛选技术在我国还没有相关的报道。由于不同国家对转基因产品的管理存在差异,所以这种快速筛选检测技术的方法以及所选用的筛选元件也不尽相同。本研究依据我国进出口转基因产品的外源基因、调控元件、标记基因和T-DNA通用序列信息建立了适合国内的转基因产品快速检测的方法。主要研究如下:
　　1、pCaMV35S和tNOS在转基因生物及其制品检测中的适用性研究:pCaMV35S和tNOS是转基因产品筛选检测中的首选参数,日常检测中发现,个别标准中的引物存在非特异性扩增和灵敏度差的问题。本实验收集了国内外标准中常用的扩增片段分别为195 bp、165 bp、147 bp、123 bp的pCaMV35S和扩增片段分别为180 bp、172 bp、165 bp、118 bp的tNOS各四对引物,应用普通PCR和实时荧光(Real-time)PCR方法,对8对引物的特异性、灵敏度及在加工品中的扩增性进行了测试和适用性评价。经过测试 pCaMV35S165bp和147 bp、tNOS172 bp和165 bp具有很好的特异性,灵敏度高,在不同的加工品中也表现出很强的检测能力,筛选检测效果最佳。pCaMV35S195 bp和tNOS180 bp扩增实验中扩增微弱,经常出现非特异性扩增。pCaMV35S123 bp和tNOS118 bp较其它引物相比扩增弱且扩增不稳定。所以本研究通过普通PCR和实时荧光(Real-time)PCR的结合对不同国标中出现的引物进行适用性评价,为转基因产品的检测监管提供可靠技术依据。
　　2、基于SYBR Green I同时检测转基因产品16种元件的快速检测技术的研究:本实验通过收集转基因产品的外源基因、调控元件、标记基因和T-DNA通用序列信息,重点考虑退火温度和扩增片段长度,设计或收集适合于一次性扩增的PCR引物SPS、PLD、Lectin、HMG I/Y、Zein、pCaMV35s、FMV35S、T-35S、E93'、g7、tNOS、Gus、Cry1Ab、cry2Ab、NptⅡ、PAT、Cry2Ab、g7、E9、barnase、barstar21组,实验中用实时荧光(Real-time) PCR方法,对21组引物的特异性、灵敏度进行了测试,结合扩增曲线、溶解曲线、Ct值以及引物正常扩增的Tm值,筛选出特异性好、灵敏度高符合转基因产品快速检测的引物。在特异性扩增实验中,SPS、PLD、Lectin、HMG I/Y、Zein、pCaMV35s、FMV35S、T-35S、E93'、g7、tNOS、Gus、Cry1Ab、cry2Ab、NptⅡ、PAT都成功得到扩增,溶解曲线均为单峰溶解曲线,空白对照没有产生相应的特异性扩增,而 barnase、barstar引物出现非常微弱的扩增,这些微弱的扩增信号可能是由于实验样品中该外源基因成分含量较低的原因。所以21组引物都具有很强的特异性。为了测定每组引物的灵敏度,所选用的植物实验材料均为1％的转基因阳性材料,在经过浓度梯度稀释,稀释后的转基因含量均小于0.01％。通过测试,21组引物中除cry2Ab、PAT的灵敏度为0.1％外,其余引物的检测灵敏度均为0.01％。计算每种引物所能检测的最低拷贝数,除 cry2Ab最低可检测42个拷贝,PAT最低可检测85个拷贝外,其余引物均能检测到低于10个拷贝。通过实验可以看出,每种引物在正常扩增是均有固定的Tm值(误差在1℃内),这就为检测转基因含量较低的样品提供了可靠的依据。
　　3、基于转录组测序对转基因水稻中 Bt基因和其他非预期基因表达的研究:本文对W1201克螟稻、W1202秀水11、W1207眀恢86、W1208 TT51、W1209明恢63、W1109科丰6进行转录组测序,比较并分析转基因水稻与其受体材料的基因表达差异,筛选出了预期表达基因Bt和转基因水稻中的非预期表达基因。Bt基因在转基因水稻中均得到表达,尤其在W1109科丰6中Bt基因表达量明显高于W1201克螟稻和W1208 TT51,而在非转基因水稻中没有出现任何表达,这从表达谱测序水平上支持了Bt基因检测的结果。通过对差异表达基因进行GO(Gene Ontology)功能和KEGG Pathway分析,这些差异表达基因按其功能主要归为生物学过程(Biological process)、细胞组分(Cellular component)、分子功能(Molecular function)三类;按代谢通路主要归为新陈代谢(Metabolism),基因信息处理(Genetic Information Processing),细胞过程(Cellular Processes)三种代谢途径。通过对差异表达基因的GO(Gene Ontology)功能和KEGG Pathway显著性富集分析,最终确定三种转基因水稻在不同生物学功能和代谢途径的表达差异。为进一步推测这些非预期差异表达基因的表达性状和效应提供重要的依据。

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第一章 文献综述

1.1 全球转基因作物的发展现状和发展趋势

1.2转基因产品的检测方法

1.3 转基因产品的安全评价与管理

1.4 本论文的研究目的、意义和主要研究内容

第二章 pCaMV35S和tNOS在转基因生物及其制品检测中的适用性研究

2.1实验材料

2.2 方法

2.3 结果与分析

2.4讨论

2.5结论

第三章 基于SYBR Green I同时检测转基因产品

3.1 实验材料

3.2 实验方法

3.3 结果与分析

3.3 讨论

第四章基于转录组测序技术对转基因水稻中Bt基因和其它非预期基因表达的研究

4.1实验方法

4.2结果分析

4.3 讨论

全文结论

参考文献

个人简历

致谢