靶向Bcl-2家族的蛋白水解靶向嵌合体(PROTACs)的设计、合成及生物学活性评价

摘要

蛋白水解靶向嵌合体（proteolysis targeting chimeras，PROTACs）通过连接基团将靶蛋白配体与E3连接酶配体利用化学键连接，将E3连接酶“募集”到靶蛋白附近，并利用细胞内的泛素-蛋白酶体系统，实现靶蛋白的泛素化标记和蛋白降解。靶蛋白一旦被降解，PROTACs分子便游离出来，参与到下一轮的蛋白结合-降解循环中，表现出超化学计量比的催化特性，突破了传统抑制剂必须持续地占据蛋白活性位点才能发挥抑制作用的局限性，为制药领域提供了新的药物设计策略。 蛋白-蛋白相互作用（protein-protein interactions，PPIs）参与到包括细胞凋亡在内的多种细胞活动当中，精密调控细胞内的多条信号转导通路。以Bcl-2家族蛋白之间的PPIs为例，Bcl-2家族蛋白的抗凋亡成员，Mcl-1和Bcl-2，通过与抗凋亡成员的PPIs调控细胞的内稳态，被认为是抗癌药物的重要靶标。然而，由于PPIs的相互作用界面平坦宽阔，抑制剂很难实现对Bcl-2和Mcl-1蛋白较高的亲和力；另一方面，Bcl-2家族蛋白成员间的结构具有较高的相似性，不利于实现抑制剂分子的选择性。 本论文针对Bcl-2家族蛋白，通过设计靶向Bcl-2家族蛋白的PROTACs分子，多轮催化靶蛋白的泛素化及降解，补偿Bcl-2/Mcl-1抑制剂亲和力较弱的缺陷；同时通过与不同靶蛋白分别形成稳定的靶蛋白-PROTAC-E3连接酶三者复合物，实现了选择性降解Bcl-2和Mcl-1蛋白，获得首批能够靶向PPIs靶点的PROTACs。 将E3连接酶CRBN蛋白的配体泊马度胺和Bcl-2/Mcl-1双抑制剂S1-6和Nap-1用烷基链或聚乙二醇链相连，构建了两个系列靶向Bcl-2家族蛋白的PROTACs，分别为H1-H5和C1-C5。其中C3和C5能够在细胞内分别泛素化并依赖蛋白酶体途径降解Mcl-1和Bcl-2蛋白，C3对Mcl-1蛋白的半数降解浓度DC50为0.7μM，C5对Bcl-2蛋白的DC50为3.0μM。虽然C3仅能够以μM级别的亲和力结合Mcl-1蛋白，但C3在体外能够以大于10的化学计量比催化Mcl-1蛋白的泛素化标记，从而使C3对Mcl-1依赖的H23细胞系的细胞杀伤能力（IC50=10.1μM）优于现有的、亲和力最高的（体外IC50达到30nM）Mcl-1选择性抑制剂，A-1210477（IC50=19.2μM）。最后，构效关系分析结合分子动力学模拟表明了PROTACs分子结构中合适长度和构象的连接基团，可以使不同靶蛋白与E3连接酶分别形成稳定的靶蛋白-PROTAC-E3连接酶三者复合物，从而以一个非选择性的Bcl-2家族蛋白抑制剂为基础，获得了选择性的Bcl-2家族蛋白PROTACs。 本文不仅获得了首批能够靶向PPIs靶点的、能够靶向Bcl-2或Mcl-1蛋白的选择性PROTACs，还为选择性PROTACs的设计提供了结构基础和指导原则。

目录

声明

1 绪论

1.1 Bcl-2家族蛋白是肿瘤靶标蛋白

1.1.1 Bcl-2家族蛋白之间的相互作用与细胞凋亡

1.1.2 Bcl-2家族蛋白小分子抑制剂是靶向抗癌药物分子

1.1.3 Bcl-2家族蛋白抑制剂的缺陷

1.2 靶向Bcl-2家族蛋白的新策略

1.2.1 双功能分子PROTACs

1.2.2 PROTACs相比于抑制剂的优势

1.3 本研究工作的指导思想和主要目标

2 靶向Bcl-2家族蛋白PROTACs的设计与合成

2.1 分子设计

2.1.1 PROTACs分子的研究进展和理性设计原则

2.1.2 “招募”CRBN（E3酶）的Bcl-2家族蛋白PROTACs的设计

2.2 合成路线设计

2.2.1 基于非那烯酮骨架的Bcl-2家族蛋白PROTACs的设计

2.2.2 基于萘酰亚胺骨架的Bcl-2家族蛋白PROTACs的设计

2.3 实验部分

2.3.1 原料和仪器

2.3.2 实验方法

2.3.3 化合物的合成

2.4 本章小结

3 靶向Bcl-2家族蛋白PROTACs的降解机制研究和生物学活性评价

3.1 PROTACs保持了抑制剂部分对靶蛋白的亲和能力

3.2 PROTACs实现Bcl-2家族蛋白的选择性降解

3.3 PROTACs可逆性降解Bcl-2/Mcl-1

3.4 PROTACs催化蛋白的泛素标记

3.5 靶蛋白-PROTACs-E3连接酶复合体是PROTACs选择性降解的分子基础

3.6 PROTACs的抗肿瘤活性优于抑制剂

3.7 本章小结

结论

参考文献

附录A 部分化合物的表征图谱

攻读硕士学位期间发表学术论文情况

致谢

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