VCIP IRES介导的人溶菌酶与牛γ干扰素共表达腺病毒载体的构建及鉴定

摘要

内部核糖体进入位点(IRES)序列是一种能够独立招募核糖体以表达蛋白的双顺反子序列，在构建多基因共表达载体的过程中发挥着重要作用。溶菌酶(Lysozyme，LYZ)是一种能够水解细胞壁内粘多糖的碱性酶，具有很广的抗菌谱，能够溶解革兰氏阳性细菌和部分革兰氏阴性细菌，甚至病毒也有一定的灭活作用。牛γ-干扰素（BoIFN-γ）是细胞在受到适宜的刺激时，在特定的诱生剂作用下，分泌的一种微量的具有抗病毒、影响细胞生长分化、抗肿瘤，调节免疫功能的糖蛋白。因此，LYZ与BoIFN-γ的联合使用对于奶牛乳房炎的防治具有很高的利用价值。绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein，GFP)是一种由238个氨基酸组成的具有独特的发光机制的蛋白，最早发现于水母中，是新型的报告基因和定位标记物。腺病毒穿梭载体(Ad vector)因其外源基因表达效率高、瞬间表达，安全性好和易获得高病毒滴度的载体等特点，在基因工程上受到了广泛的应用。
　　为了获得能高效表达人溶菌酶(hLYZ)与牛γ干扰素（BoIFN-γ）的双表达腺病毒载体，本实验分别从人和鼠的基因组中克隆出人胶原诱导蛋白(hVCIP) IRES序列，命名为hIRES和鼠胶原诱导蛋白(mVCIP) IRES序列，命名为mIRES;从含有人溶菌酶基因(hLYZ)的pCDNAK-LYZ载体上PCR扩增出hLYZ序列;从含有GFP基因的pEGFP-N1载体上扩增出GFP序列。经测序正确后，分别插入腺病毒穿梭载体Pshuttle-cmv的相应位点，构建获得Pshuttle-hLYZ-hIRES-GFP和Pshuttle-hLYZ-mIRES-GFP两种重组腺病毒载体。用脂质体法分别转染PK15、AAV293和牛肾细胞，经荧光显微镜观察和FACS检测，结果显示，两种IRES均成功介导了下游基因GFP的表达，不同的细胞中，报告基因GFP的表达量存在较大差别。用BoIFN-γ替换GFP基因，获得Pshuttle-hLYZ-mIRES-BoIFN重组腺病毒载体，在AAV-293细胞内包装成腺病毒，经RT-PCR检测，结果表明，本实验成功获得了hLYZ和BoIFN-γ双表达腺病毒。