重组腺病毒pCMV-NM23-IRES-EGFP载体的构建及鉴定

摘要

目的构建携带有NM23的重组腺病毒载体并观察其对人胃癌细胞株BGC-823凋亡的影响。方法以质粒NM23-PIRES2-EGFP为模版,采用PCR扩增NM23基因,克隆至腺病毒载体p CMV-MCS-IRES-EGFP上,形成重组腺病毒载体p CMV-NM23-IRES-EGFP并酶切鉴定及基因测序。将人胃癌细胞株BGC-823分为实验组(NM23-OE组,感染p CMV-NM23-IRES-EGFP)、空白组(Ctrl组),阴性对照组(NC组,感染p CMV-MCS-IRES-EGFP);Real Time PCR和Western Blot分别检测3组细胞中NM23mRNA和蛋白表达;流式细胞仪检测3组细胞凋亡率。结果经酶切鉴定和基因测序证实成功构建重组腺病毒p CMV-NM23-IRES-EGFP;经扩增后,重组腺病毒的滴度为4.0×1010ifu/m L;RTPCR及Western blot结果显示,阴性对照组与空白组相比差异无统计学意义(P>0.05),而实验组的NM23的mRNA和蛋白表达显著高于其他两组(P<0.05);实验组BGC-823细胞的凋亡率也显著高于其他两组(P<0.05)。结论成功构建了过表达NM23的重组腺病毒p CMV-NM23-IRES-EGFP载体,通过上调NM23基因的表达,可观察到胃癌细胞株BGC-823的凋亡水平有明显升高,为后续研究NM23基因对人胃腺癌细胞生物学功能的影响提供实验基础。