候选基因LBC在鸡精原干细胞形成过程中的作用研究

摘要

精原干细胞(Spermatogonial stem cells，SSCs)是雄性成体干细胞中唯一一种能够将遗传物质传递给下一代的干细胞。SSCs作为生殖干细胞，是精子发生的基础，在研究精子发生机制、阐述男性不育病因和治疗男性不育症等领域有着不可替代的作用。精原干细胞的形成受到相关基因的调控，但是其具体分子机制现在仍然未知。本研究针对精原干细胞上特异表达候选基因LBC进行功能验证，以如皋黄鸡作为试验动物，在体外和体内通过敲除和过表达LBC基因的方法，研究LBC基因在鸡精原干细胞形成过程中的作用，为阐明精原干细胞发生及分化机制提供参考。
　　本文主要研究如下:
　　1.如皋黄鸡LBC基因的克隆根据NCBI提供的LBC基因序列，设计引物克隆LBC基因的CDS区，并将其连接至pMD19-T载体中进行测序。测序结果表明pMD19-T-LBC构建正确，与公布的原鸡LBC基因CDS区同源性达99.43％，编码氨基酸有两个发生改变，成功克隆出如皋黄鸡中LBC基因，可用于后续研究。
　　2.LBC基因多克隆抗体制备及亚细胞定位研究制备LBC基因的抗原多肽，注射小鼠进行免疫，收集血清后通过间接免疫荧光技术(IFA)进行抗体效价检测;构建真核表达载体pEGFP-N1-LBC，转染DF-1细胞48 h后于荧光倒置显微镜下观察转染结果，并利用RT-PCR和间接免疫荧光试验进一步鉴定LBC-eGFP mRNA和蛋白水平的表达状况。结果发现，RT-PCR能检测到融合蛋白转录水平的表达，荧光显微镜观察和IFA检测结果都显示LBC-eGFP融合蛋白在细胞核和细胞质中都有表达，与生物信息学预测结果相一致。
　　3.LBC基因对精原干细胞形成的影响构建LBC敲除载体CRISPR/Cas9-LBC和过表达载体pcDNA3.0-LBC，转染DF-1细胞后利用测序、T7E1酶切和Western Blot技术验证载体活性;分别转染ESC，在RA诱导培养基中培养，采用形态学观察、免疫化学检测和QRT-PCR等方法在体外检测LBC缺失与过表达对ESC向SSC分化的影响，同时鸡胚注射CRISPR/Cas9-LBC和pcDNA3.O-LBC载体，采用石蜡切片和流式分析的方法在体内检测LBC缺失与过表达对PGCs和SSCs形成的影响。结果表明CRISPR/Cas9-LBC和pcDNA3.0-LBC载体均构建成功且具有活性;体外实验中，与RA诱导组相比，LBC过表达显著地促进了ESC向SSC的分化，且integrinα6、integrinβ1等SSCs标记基因的表达量也有显著的增加，在第10天，相对于诱导组中integrinα6的相对表达量(1.96)，在过表达组中达到2.34;相反的，LBC敲除，ESCs向SSCs的分化受到一定程度的抑制，第6天克隆形成之后，不能形成精原样细胞，且全能性标记基因Sox2的表达量的降低受到抑制，相对于诱导组中相对表达量(0.96)，在敲除组中达到1.03，integrinα6、integrinβ1表达量也相对减少;体内试验中，与正常发育的鸡胚相比，LBC过表达显著的促进了PGC和SSC细胞的生成，而LBC敲除相对减少了PGC和SSC细胞的生成。

目录

论文说明

摘要

缩略词表

第一章 文献综述

1 精原干细胞

2 精原干细胞的来源

3 精原干细胞形成过程中的标记基因

4 精原干细胞形成过程中的基因调控

5 精原干细胞形成的诱导体系

6 本研究的目的和意义

参考文献

第二章 LBC基因cDNA序列的克隆

1 材料与方法

1．1 实验材料与试剂

1．2 主要仪器和设备

1．3 引物设计与合成

1．4 鸡睾丸组织总RNA提取

1．5 睾丸组织RNA的反转录

1．6 LBC基因克隆

1．7 LBC基因TA克隆及测序

2 结果

2．1 LBC的PCR扩增结果

2．2 菌液PCR结果

2．2 测序结果

3 讨论

4 本章小结

参考文献

第三章 LBC基因多抗制备及亚细胞定位研究

1 材料与方法

1．1 试验材料

1．2 试验试剂

1．3 引物设计与合成

1．4 小鼠抗LBC基因多克隆抗体的制备及其效价检测

1．5 DF-1细胞的传代培养

1．6 真核表达载体pEGFP-N1-LBC的构建

1．7 LBC蛋白的亚细胞定位预测

1．8 真核表达载体转染试验

1．9 融合表达载体在mRNA水平上的检测

1．10 IFA检测LBC蛋白的表达

2 结果与分析

2．1 LBC基因多克隆抗体的制备

2．2 DF-1细胞的培养

2．3 真核表达载体的构建

2．4 LBC蛋白亚细胞定位预测

2．5 融合蛋白eGFP-LBC在细胞中的定位

2．6 融合表达载体在mRNA水平上的检测结果

2．7 IFA检测LBC基因蛋白的表达

3 讨论

4 本章小结

参考文献

第四章 LBC基因对鸡胚胎干细向精原干细胞分化的影响

1 材料与方法

1．1 试验材料

1．2 试验试剂

1．3 LBC基因敲除载体的构建

1．4 真核表达载体pcDNA3．0-LBC的构建

1．6 Western Blot检测CRISPR／Cas9-LBC和pcDNA3．0-LBC活性

1．7 LBC基因功能体外验证

1．8 LBC基因功能体内验证

2 结果

2．1 过表达载体pcDNA3．0-LBC载体的构建

2．2 LBC基因敲除载体的构建和DF-1细胞上的活性验证

2．3 LBC基因敲除和过表达在体外对ESCs向SSCs分化的影晌

2．4 LBC基因敲除和过表达在体内对PGCs和SSCs发生的影响

3 讨论

4 本章小结

参考文献

第五章 结论和创新点

附录

致谢

硕士期间发表的论文

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