鸡精原干细胞介导转基因的研究

摘要

精原干细胞(spermatogonial stem cells，SSCs)是雄性生殖细胞的前体细胞，具有终生扩增性和永生性，是生殖系中唯一的在成体中还能增殖的细胞。目前，SSCs的研究对动物精子发生发育机理、医学临床的男性生殖生理和转基因动物的制备方面具有广阔的应用前景，己成为干细胞研究的热点之一，本研究进行了体内、外鸡SSCs转染外源基因(pEGFP-N<,1>)建立转基因鸡的探索，对转染后外源基因在当代、F<,1>、F<,2>代精子、种蛋胚盘及不同孵化日龄胚胎及其组织器官中的整合、表达情况进行了检测。研究结果如下几个方面： 1．对公鸡睾丸内注射pEGFP-N<,1>，观察体内精原干细胞转染外源基因整合以及在后代中表达情况。实验鸡在注射pEGFP-N<,1>一个生精周期(25d左右)后，定期检测(转染后25～240d内，每隔l周检测1次)公鸡精子转染表达情况及southern blot检测，结果发现：实验鸡在转染70d后精子荧光表达率最高为19.1％，并维持到180d后转染率明显下降至15％左右，此后一直保持这一转染水平：对转染后48h 0世代实验公鸡睾丸细胞、原始生殖细胞和10d胚龄成纤维细胞，检测其荧光转染率，结果显示：转染48h的公鸡睾丸细胞表达有绿色荧光蛋白；孵化5.5d鸡胚的原始生殖细胞和孵化10d的鸡胚成纤维细胞绿色荧光表达率各为50.00％和66.67％；对0世代实验鸡睾丸组织以及后代中不同组织(胚盘、胚胎、心脏、肾脏、肝脏以及肌肉)，进行冰冻切片检测和southern blot检测。结果显示：0世代实验鸡睾丸组织，可清晰看到曲细精管中转染细胞绕管分布呈环状。F<,1>、F<,2>代鸡胚胎不同组织间荧光蛋白表达强弱差异，在肝脏、肾脏表达强度高，其余组织荧光表达强度弱：未经孵化的F<,1>、F<,2>代新生胚盘中阳性率各为71.69％和67.29％，F<,1>代胚盘的PCR阳性率为69.64％，孵化的胚胎PCR阳性率为60.08％，F<,2>代胚盘、胚胎的PCR阳性率各为61.33％和57.35％，经southem杂交检测，证实外源基因(EGFP)已整合到精子基因组，且能通过体外受精在后代中稳定表达。因此，睾丸内注射法可能是一种可行、简单并利于推广的制备转基因鸡的方法。 2．对接受精原干细胞移植的实验受体鸡，预先进行白消安处理，消除其内源性精原干细胞，结果显示：白消安处理20d后，完全消除了内源性精原干细胞，可用于外源精原干细胞移植。电穿孔法转染供体精原干细胞，转染后培养2d时检测转染率为19.70％，培养10d时，转染率为4.72％：筛选转染后表达荧光蛋白的精原干细胞移植入实验受体鸡睾丸内，一个生精周期(25d左右)后，采集不同时间阶段实验鸡精液，进行常规检测，结果显示：移植25d后，采集精液发现，精液呈清水状，精子密度和荧光表达率分别为1.57(10<'4>个/ml)和4.68％，移植75d时，精液为淡白色，精子密度和荧光表达率分别为1.35(10<'5>个/ml)和8.02％；精子DNA的PCR．检测结果为阳性。对移植75d实验鸡睾丸组织制作冰冻切片，观察到携带外源基因的精原干细胞在曲细精管表达绿色荧光蛋白。但精子密度偏低，不符合人工授精的要求，利用精原干细胞移植生产转基因家禽还需进一步探索。

目录

文摘

英文文摘

文献综述

实验部分

实验一鸡胚精原干细胞体内转染EGFP基因

1材料与方法

2结果

3讨论

实验二体外转染EGFP基因的精原干细胞移植

1材料与方法

2结果

3讨论

结论

参考文献

附录

致谢

攻读学位期间发表的论文