新疆酸驼乳中微生物种群结构的分子解析及优势菌群的分离与鉴定

摘要

舒巴特(Shubat)是一种新疆特有的传统发酵酸驼乳,其口感特殊,风味浓郁,营养丰富,极具民族特色。研究发现,驼乳可以帮助糖尿病患者减少对胰岛素的依赖,对婴儿也很有益。而且,酸驼乳对消化道溃疡,高血压等疾病都有辅助治疗作用。
　　 酸驼奶的传统制作方法十分奇特,新鲜驼奶不经过消毒直接放入专用的,萨克民族称之为“撒巴”羊皮囊中,室温放置发酵24-48小时便酿制成酸驼奶。酸驼奶被饮用后再补充相同体积的新鲜驼奶,这种发酵过程可以持续数月.从“撒巴”制作酸驼奶的独特工艺来看,其中一定蕴藏着丰富的微生物资源,极有可能成为优良益生菌的来源。
　　 本研究以新疆牧民家庭自然发酵的酸驼奶(shubat)为材料,采用PCR-DGGE指纹技术分析酸驼奶中乳酸菌及酵母菌的分子多样性,并结合传统平板技术分离优势菌种；通过单菌株在驼奶里的生长研究其对驼奶发酵的影响,以期阐明酸驼乳发酵的机理,为民族产品的工业化生产提供了理论依据。主要研究结果如下:
　　 1.按照传统方法制备酸驼乳,研究发酵过程中乳酸菌、酵母菌及大肠菌群等主要微生物群的动态变化；并对发酵奶pH值、理化指标(灰分,脂肪、蛋白质)粘度以及和微生物指标(大肠菌群、乳酸菌、酵母菌和霉菌)进行了分析和研究。结果显示,自然发酵过程中乳酸菌和酵母菌随时间而数量增加,发酵终止时两者数量分别为4.3×107和2.8x106CFU/mL；新鲜驼奶中大肠菌群数量为102 CFU/mL以上。随后大肠菌群数量急剧下降,到发酵完成时,大肠菌群为阴性。霉菌始终没有检出。理化分析结果表明,酸驼乳中蛋白质、脂肪、灰分的含量分别为4.21％、2.81％和0.98％；调查发现不同地区采集的酸驼乳样品其酸度、pH值、粘度等有明显差异；感官评价表明,酸驼乳可分成Ⅰ、Ⅱ两种类型:类型Ⅰ奶质稀薄、酸味柔和,类型Ⅱ奶质粘稠、酸味浓烈。
　　 2.采用PCR-DGGE指纹技术,比较了9份传统发酵酸驼乳中微生物种群结构,图谱相似性分析结果表明不同来源的酸驼乳中微生物组份存在差异,样品间细菌种群结构的相似性为78％-84％,酵母菌种群结构的相似性为80％-92％。分别对酸驼奶细菌和酵母菌DGGE图谱上主要条带的DNA进行回收、PCR扩增、测序,通过序列分析和相似性比较,结果表明酸驼乳中细菌群落结构包括巨型球菌Macrococcus caseolyticus,瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus),短乳杆菌(Lactobacillus,brevis),香肠魏氏菌(Weissella hellenica),清酒乳杆菌(Lactobacillus sakei),肠球菌(Enterococcus durans),屎肠球菌(Enterococcus faecium)及乳酸明串珠菌(Leuconostoc lactis)等；酵母群落结构主要包括为巨大克洛维酵母(Kluyveromyces marxianus)和单孢酿酒酵母(Kazachstania unispora),嗜酒假丝酵母(Candida ethanolica)及一种地霉(Geotrichum sp).此结果对进一步从自然发酵酸驼乳中分离筛选优势乳酸菌和酵母菌有重要指导意义。
　　 3.从7份采自新疆维吾尔自治区喀纳斯湖周边及布尔津县的自然发酵酸驼奶共分离到48株菌株乳酸菌和15株酵母菌菌株。乳酸菌菌株根据其细胞形态,二氧化碳产生,精氨酸产氨,乳酸构型等生理生化特性以及在不同温度和盐度条件下的生长情况等分成6组,分别称之为组Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ,Ⅴ,Ⅵ。采用API50 CH鉴定系统进行生理生化鉴定结合16srDNA序列分析鉴定,6组乳酸菌菌株被鉴定为清酒乳杆菌(Lactobacillus sakei),瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus),短乳杆菌(Lactobacillusbrevis),粪肠球菌(Enterococcus faecium),屎肠球菌(Enterococcus feacalis),乳明串珠菌(Leuconostoc lactis)及香肠魏氏菌(Weissella hellenica),其中Lb.sakei分离频率最高的乳酸菌(占分离株总数26％),其次是Enterococcus faecium(占14％)和Lactobacillus helveticus。酵母菌菌株根据其26S rDNA的D1区PCR—DGGE图谱分为3组,通过对26SrDNA ITS序列进行扩增和测定并与数据库序列比对,结果表明3组酵母菌分别被鉴定为巨大克洛维酵母(Kluyveromyces marxianus),单孢酿酒酵母(Kazachstania unispora),嗜酒精假丝酵母(Candida ethanolica),其中Kluyveromycesmarxianus是分离频率最高的优势酵母菌(占14％)。
　　 4.本研究建立了一种基于特有菌落形态与katA基因相结合的清酒乳杆菌检测方法。利用此方法跟踪驼乳的发酵过程,发现所有低粘、低酸型(即类型Ⅰ)自然发酵酸驼乳中都含有清酒乳杆菌在存在。用不合清酒乳杆菌酸驼乳和含有清酒乳杆菌的酸驼乳作为自然发酵剂分别接种新鲜消毒驼乳,结果表明接种含有清酒乳杆菌的酸驼乳的新鲜驼乳其粘度随着时间延长而逐渐下降；相反接种不含清酒乳杆菌酸驼乳的新鲜消毒驼乳,其粘度随着时间延长而有增高。进一步用分离自酸驼乳的清酒乳杆菌与6株其他乳酸菌分别接种新鲜消毒驼乳,结果表明接种清酒乳杆菌的驼乳粘度均有下降；相反接种其他乳酸菌的驼乳粘度均有不同程度的增加。这一结果初步揭示了在低酸、低粘型传统驼乳发酵中清酒乳杆菌起重要作用。