功能性低聚糖的酶法合成及其生理功能评价

摘要

功能性低聚糖属于益生元的一类,是有别于普通低聚糖的一类功能因子,其包含多种类型的物质,新型功能性低聚糖的开发是国际益生元界的热点问题,酶工程技术的发展为解决这一问题提供了契机。同时由于功能性低聚糖本身结构的特殊性以及分离纯化较为困难,在过去的研究中通常采用商品化的产品,或者将其仅进行简单分离就作为底物进行益生功能评价,因而并不能从本质上说明是混合物中的哪一种确定结构的低聚糖在厌氧发酵过程中发挥了积极作用,也不能确定低聚糖结构对于其益生功能以及抑癌活性的影响。在前人的研究中已经发现功能性低聚糖的化学结构(包括单糖残基的类型和组成、糖苷键的构型和连接方式)对于益生功能以及抑癌活性都有重大的影响作用,特别是低聚糖在肠道内的选择特性和发酵特性,因此从理论上阐明功能性低聚糖的精细结构与其生理功能问的关系具有重大意义。本文分为五个部分,分别重点对不同来源的β-D-半乳糖苷酶合成新型功能性低聚糖、各种单一组分低聚糖的分离纯化以及结构鉴定、酶法合成的条件优化、不同结构低聚糖纯品体外肠道益生功能比较、不同结构低聚糖纯品体外抑制人胃癌细胞株BGC-823作用进行了研究。主要研究结果如下:
　　 1.酶法合成功能性低聚糖及其分离纯化、结构鉴定本研究选用来源于Bacillus circulans、Penicillum multicolor和Aspergillusoryzae中的β-D-半乳糖苷酶作为催化剂,分别以乳糖、乳糖和蔗糖、乳糖和N-乙酰葡萄糖胺为底物进行酶法合成,并且使用HPLC监测整个反应进程,探究不同来源的酶在不同底物存在条件下产物的种类。通过高压、中压、常压色谱结合活性炭-硅藻土吸附层析和凝胶排阻吸附层析等分离手段对酶法合成的产物进行分离纯化,得到9种低聚糖纯品,将纯化所得的各物质纯品通过UV、ESI-TOF-MS、1H-NMR、13C-NMR等分析手段进行结构表征,同时还对一种商品化的低聚果糖QHT-90S混合物进行了HPLC分析并进行了结构表征。发现来源于B.circulans中的β-D-半乳糖苷催化的反应生成的产物主要以β-(1→4)糖苷键形式存在,另外还有少量以β-(1→3)和β-(1→6)糖苷键形式存在,产物的聚合度为2至4。酶法合成后纯化得到其中的三种物质:β-D-Galp-(1→4)-β-D-Galp(1→4)-α-D-Glcp-(1→2)-β—D-Fruf、β-D-Galp-(1→4)-β—D-Galp-(1→4)-β—D-Galp-(1→4)-D-GlcpNAc和β—D-Galp-(1→4)-β-D-Galp-(1→4)-D-GlcpNAc前人未见报道,为合成后首次命名。来源于P.multicolor和A.oryzae中的β-D-半乳糖苷催化的反应结果相似,前者的催化效力和专一性要强于后者,产物主要以β-(1→6)糖苷键形式存在,另外还有少量以β-(1→4)糖苷键形式存在,产物的聚合度最高为3至4。
　　 2.酶法合成功能性低聚糖的条件优化本文对反应温度、底物浓度、供受体比以及酶浓度等反应条件进行研究,确定了合成各种GOS、乳果糖及其类似物、N-乙酰乳糖胺及其衍生物纯品的最优条件。研究表明反应温度、底物浓度以及供受体比的变化对于产物的合成影响较大,为主要的影响条件,而酶浓度对于各产物最高产量的影响不显著,为次要影响条件。
　　 经过对反应优化,确定了各物质合成的最佳条件如下:(1)4'-GOS3:40℃,pH6.0,60％的乳糖浓度,1.0 U/mL的酶浓度(来源于B.circulans的β-D-半乳糖苷酶)反应6 h；(2)4'-GOS4:40℃,pH6.0,60％的乳糖浓度,1.0 U/mL的酶浓度(来源于B.circulans的β—D-半乳糖苷酶)反应8 h；(3)6'-GOS3:50℃,pH5.0,70％的乳糖浓度,0.3 U/mL的酶浓度(来源于P.multicolor的β-D-半乳糖苷酶)反应6 h；(4)6'-GOS4:50°,pH5.0,70％的乳糖浓度,0.3 U/mL的酶浓度(来源于P.multicolor的β—D-半乳糖苷酶)反应8 h；(5)乳果糖和4'-galactosyl-lactosucrose:40℃,pH6.0,60％的总糖浓度(30％乳糖和30％蔗糖),1.0 U/mL的酶浓度(来源于B.circulans的β—D-半乳糖苷酶)反应6 h；(6)异乳果糖:50℃,pH6.0,60％的总糖浓度(30％乳糖和30％蔗糖),1.0 U/mL的酶浓度(来源于B.circulans的β—D-半乳糖苷酶)反应12 h；(7)N-乙酰乳糖胺、4'-galactosyl—LacNAc以及4'-digalactosyl-LacNAc:40℃,pH6.0,1.0 M的总糖浓度(0.5 M乳糖和0.5 M N-乙酰葡萄糖胺),1.0U/mL的酶浓度(来源于B.circulans的β-D-半乳糖苷酶)分别反应4、5、6 h；(8)N-乙酰异乳糖胺:60℃,pH6.0,1.0 M的总糖浓度(0.5 M乳糖和0.5 MN-乙酰葡萄糖胺),1.0 U/mL的酶浓度(来源于B.circulans的β-D-半乳糖苷酶)反应12 h。
　　 3.不同结构功能性低聚糖纯品体外肠道益生功能研究本文利用体外厌氧粪样混合培养的方法对酶法合成得到的不同键合形式、不同聚合度的系列GOS、FOS,乳果糖及其类似物纯品进行研究,利用FISH技术比较总菌群数、有益菌以及有害菌的数量,并用PI评价受试底物的益生功能；通过发酵过程中各种SCFA种类和含量的变化,确定了菌群代谢对产生SCFA的影响,在一定程度上阐明了其结构与益生功能之间的关系。
　　 (Galactosyl)n-glucose(n=1-3)结构的GOS相比较glucose-(fructosyl)n(n=1-3)结构的FOS,PI值更高。GOS系列低聚糖对Bifidobacterium spp.具有很强的选择性,相应在发酵过程中有大量乙酸和乳酸生成,在GOS中,以β-(1→6)糖苷键相连的GOS(6'-GOS3)比β(1→4)糖苷键相连的COS产生了更高的PI；而FOS系列低聚糖却对Lactobacillus/Enterococcus spp.具有较强的选择性。GOS系列低聚糖的丁酸产生量都比FOS系列低聚糖高。聚合度也会对PI造成影响,聚合度≤3的低聚糖通常12 h时PI就能达到最大值,而聚合度>3的低聚糖通常要24 h才能达到最大值,聚合度越高,益生功能越持久。除两种普通低聚糖(乳糖和蔗糖)在24 h会引起Bacteroides-Prevotella group和Clostridiumhistolyticum group(clustersⅠ andⅡ)数量明显增加外,其余低聚糖与对照组相比对两种菌属均无增殖作用。
　　 以β-(1→4)糖苷键相连的三糖,即结构为(galactosyl)2-glucose的4'-GOS3与结构为galactosyl—glucosyl—fructose的乳果糖相比,会产生更高的PI值,而且在整个反应时间内,Bifidobacterium spp.和Lactobacillus/Enterococcus spp.在总菌群中所占的比例均在不断提高,若(galactosyl)2-glucose结构中半乳糖残基间的连接变成β-(1→3)糖苷键形式(异乳果糖),对PI影响较大。在整个反应时间内,异乳果糖的PI均高于4'-GOS3,同时异乳果糖在24 h时总酸量最高。以α-糖苷键相连的棉籽糖在24 h还会引起Clostridium histolyticum group(clustersⅠ andⅡ)数量的增加,这不利于PI的提高,而其得到的总酸量也是所有低聚糖中最少的。
　　 4.不同结构功能性低聚糖纯品体外抑制人胃癌细胞株BGC-823作用研究本文研究了不同键合形式、不同聚合度的的GOS、FOS、乳果糖及其类似物纯品对人胃癌细胞株BGC-823细胞的体外增殖的影响,通过比较不同作用时间以及不同作用浓度下各种功能性低聚糖纯品对于胃癌细胞的抑瘤率,初步探讨不同结构功能性低聚糖纯品对胃癌细胞的作用效果,在一定程度上阐明了低聚糖结构对于癌细胞生物活性的影响。
　　 结果表明除棉籽糖外,其它低聚糖的抑瘤率与其浓度问均存在剂量依赖关系,在相同时间条件下,随浓度的升高,抑瘤率逐渐增强；在相同的浓度下,随时间的延长,抑瘤率也相应提高。比较低浓度(10 mg/mL)下各低聚糖的抑瘤率可知以β-(1→3)糖苷键相连的异乳果糖对癌细胞的抑制率要高于以β-(1→4)糖苷键相连的乳果糖和GOS(4'-GOS3和4'-GOS4)；以β-(1→2)糖苷键相连的FOS系列低聚糖也取得了较高的抑瘤率,但两种以β-(1→6)糖苷键相连的GOS(6'-GOS3和6'-GOS4)在整个反应过程中抑瘤率一直较低；同种类型低聚糖其三糖和四糖之间抑瘤率差异不显著。