产γ-氨基丁酸乳酸菌选育及其发酵鹰嘴豆乳对神经细胞损伤的保护作用

摘要

γ-氨基丁酸(GABA)是一种天然存在的非蛋白质氨基酸，作为抑制性神经递质，具有降血压、抗焦虑、延缓脑衰老，营养神经、抗氧化等多种生理功能，生产富含GABA的功能性食品，能更好地发挥其保健功效。乳酸菌是公认安全的一类益生菌，广泛用于食品发酵，且其具有将谷氨酸或谷氨酸钠转化成GABA的能力，因此，可采用乳酸菌发酵的方式来增加食品中的GABA含量，增强食品的营养和功能特性。鹰嘴豆营养丰富，具有较好的食用和药用价值，可作为乳酸菌生长并富集GABA的良好食品基质。在对其功能的研究上，选用神经细胞的模式细胞株PC12细胞，利用MnCl2对细胞造成损伤，考察富含GABA的发酵鹰嘴豆乳提取物对损伤细胞的保护作用及机制，将有助于更好地理解鹰嘴豆乳中功能性因子GABA的作用，同时为富含GABA鹰嘴豆乳保健功效的研究提供一定的理论基础。
　　本研究旨在对具有产GABA能力的乳酸菌进行筛选，通过诱变和利用响应面优化法提高菌株在鹰嘴豆乳中的GABA产量，从而获得富含GABA鹰嘴豆乳的生产工艺，进一步采用MnCl2损伤的PC12细胞模型探讨富含GABA的鹰嘴豆乳提取物对神经细胞的保护作用及机制，主要研究结果如下:
　　1.通过纸层析初筛、液相复筛，从分离自传统发酵食品的377株乳酸菌中筛选到17株能产GABA的菌株，其中M-6产量最高，发酵48h后，其在含1％谷氨酸钠(MSG)的MRSG培养基和含0.2％ MSG的鹰嘴豆乳中的GABA产量分别为584.26 mg/L和282.12 mg/L。经形态学观察、生理生化试验及16S rDNA基因鉴定，确定M-6为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）。植物乳杆菌M-6含调控GABA合成的谷氨酸脱羧酶(GAD)基因，该基因全长1410 bp，编码含469个氨基酸的蛋白，预测分子量53.7kDa，等电点pI为5.58，其与植物乳杆菌GB01-21、Taj-Apis362、德氏乳杆菌保加利亚亚种ATCC11842、短乳杆菌OPK-3、乳酸乳球菌的GAD氨基酸序列分别显示99％，99％，94％，94％，68％的相似性。
　　2.以植物乳杆菌M-6作为出发菌株，分别进行紫外、紫外-氯化锂复合诱变，确定紫外照射最佳时间为240 s，氯化锂最佳浓度为0.15％，此时致死率为80％左右，有利于正突变的发生。经诱变后，菌株的形态未发生明显改变。采用MSG平板法、纸层析法、berthelot比色法和高效液相色谱(HPLC)法对突变株的产GABA特性进行监测，筛选到21株GABA产量高于出发菌株的突变株，其中紫外-氯化锂诱变所得突变株M'-6产量最高，其在MRSG培养基(含1％ MSG)和鹰嘴豆乳(含0.2％ MSG)里的产量分别为899.27 mg/L和369.53mg/L，比出发菌株分别提高64.25％和30.46％，具有良好的遗传稳定性。
　　3.通过单因素试验和响应面分析得出植物乳杆菌发酵的鹰嘴豆乳产GABA的最优条件为:底物MSG0.2％、磷酸吡哆醛(PLP)55μM、pH自然、接种量7％、发酵温度39℃，经48 h发酵，GABA可达537.23 mg/L，完全可以满足人体每天对GABA的需求量为30-100 mg的要求。鹰嘴豆乳在发酵产GABA的过程中，可溶性蛋白含量下降，说明菌体可利用可溶性蛋白;蛋白电泳结果显示鹰嘴豆蛋白的7Sα'亚基和11S碱性亚基更容易被植物乳杆菌利用;反相高效液相色谱(RP-HPLC)结果显示发酵过程中有一些小肽的生成，也有一些小肽被菌体的肽酶利用;发酵过程中，游离氨基酸态氮(FAN)含量上升，且FAN浓度与GABA浓度呈显著正相关(r2=0.762，P＜0.01);游离氨基酸检测结果显示:几乎所有氨基酸含量都有所上升，必需氨基酸含量上升。蛋白降解过程可为GABA的生成提供底物，从而促进GABA的产生，同时有助于增强鹰嘴豆乳的营养与功能特性。
　　4.经MTT法测定，富含GABA的发酵鹰嘴豆乳提取物(FCE)在500-2000μg/mL的浓度范围内对PC12细胞无毒性，建立750μM MnCl2损伤的PC12细胞模型，FCE能够显著地提高细胞的存活率，且随浓度增大，保护作用增强。倒置相差显微镜结果显示FCE能够使损伤细胞的形态恢复正常，保持细胞的完整性和良好的贴壁性;荧光显微镜观察结果显示FCE能够使得损伤细胞的比例减少，正常细胞的比例增多;FCE能够保持细胞膜的完整性，从而降低损伤细胞培养液中的乳酸脱氢酶(LDH)酶活;FCE能够提高MnCl2诱导的损伤细胞中的抗氧化酶:超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)酶活及抗氧化物谷胱甘肽(GSH)的含量，且呈现剂量依赖效应;流式细胞仪分析表明FCE能够显著降低PC12细胞内的活性氧(ROS)水平，且降低细胞的凋亡率;细胞周期分析表明，FCE有助于缓解MnCl2损伤导致的S期阻滞，使得细胞分裂顺利进行;此外，FCE有助于降低凋亡关键酶Caspase-3的酶活。以上结果皆表明:富含GABA的FCE可以对抗MnCl2导致的PC12细胞的凋亡，从而能够起到保护PC12细胞免受MnCl2损伤的目的。

目录

声明

摘要

缩略词表

第一章 文献综述

1 鹰嘴豆的营养功能及开发

1．1 鹰嘴豆简介

1．2 鹰嘴豆的营养价值

1．3 鹰嘴豆的保健及药用价值

1．4 鹰嘴豆资源的开发

2 乳酸菌及其发酵食品

2．1 乳酸菌概述

2．2 乳酸菌发酵食品

3 γ-氨基丁酸

3．2 γ-氨基丁酸的生理功能

3．3 乳酸菌发酵产γ-氨基丁酸

3．4 富含GABA功能性食品的开发及应用

4 本研究的目的、意义及主要研究内容

4．1 研究目的及意义

4．2 主要研究内容

参考文献

第二章 产γ-氨基丁酸乳酸菌的筛选及鉴定

1 材料和方法

1．1 实验材料

1．2 实验方法

2 结果与分析

2．1 预染纸层析法的检出限及分离效果

2．2 纸层析筛选

2．3 高效液相色谱定量

2．4 LC-MS鉴定发酵产物

2．5 菌株形态学鉴定

2．6 生理生化特性

2．7 分子生物学鉴定

2．8 GAD基因序列分析

3 讨论

4 本章小结

参考文献

第三章 产γ-氨基丁酸植物乳杆菌的诱变选育

1 材料和方法

1．1 实验材料

1．2 实验方法

2 结果与分析

2．1 出发菌株的生长曲线

2．2 紫外诱变最佳时间的确定

2．3 紫外-氯化锂复合诱变剂量的确定

2．4 出发菌株和诱变菌株的形态特征比较

2．5 初筛

2．6 Berthelot比色法及HPLC法复筛

2．7 遗传稳定性结果

3 讨论

4 本章小结

参考文献

第四章 植物乳杆菌发酵鹰嘴豆乳产γ-氨基丁酸条件优化及对蛋白降解的影响

1 材料和方法

1．1 实验材料

1．2 实验方法

2 结果与分析

2．1 不同豆乳发酵产GABA的比较

2．2 发酵鹰嘴豆乳产GABA的条件优化

2．3 最优条件下鹰嘴豆乳发酵的时间曲线

2．4 主要营养物质的变化

2．5 可溶性蛋白的变化

2．6 蛋白电泳

2．7 肽谱分析

2．8 游离氨基酸态氮(FAN)

2．9 游离氨基酸(FAA)含量变化

2．10 感官鉴评结果

3 讨论

4 本章小结

参考文献

第五章 富含γ-氨基丁酸鹰嘴豆乳对MnCl2诱导的PC12细胞损伤的保护作用及机制

1 材料和方法

1．1 实验材料

1．2 实验方法

2 结果与分析

2．2 MnCl2诱导PC12细胞损伤模型的建立

2．3 FCE／UCE对MnCl2诱导的PC12细胞损伤的保护作用

2．4 倒置相差显微镜观察细胞形态

2．5 荧光显微镜观察结果

2．6 LDH活力测定

2．7 胞内GSH、SOD及CAT的检测

2．8 ROS检测

2．9 细胞凋亡率的测定

2．10 细胞周期的测定

2．11 Caspase-3酶活的检测

3 讨论

4 本章小结

参考文献

全文结论

论文创新点

工作展望

致谢

攻读博士学位期间发表和录用的论文