塔格糖的生物制备及L-阿拉伯糖异构酶性质研究

摘要

塔格糖(D-tagatose)属于稀有糖，是一种在自然界中存在较少的单糖，其甜味类似于蔗糖，而热量值较低，同时还具有抗氧化、降低血糖、益生元及防龋齿的功能特性。塔格糖的生物转化主要利用L-阿拉糖异构酶(L-arabinose isomerase，AI)异构化半乳糖a本论文主要研究：筛选高产AI的乳酸菌；优化乳酸菌发酵产AI的工艺参数；乳酸菌AI的分离纯化和酶学性质；AI酶活性部位的化学修饰；渗透乳酸菌细胞生物转化塔格糖的工艺条件。 利用半胱氨酸．咔唑法、薄层层析法快速筛选得到产AI的乳酸菌Lactobacillus SK-2，根据细胞形态、生化特性，结合16S rDNA，判定Lactobacillus SK-2属于植物乳酸杆菌，命名为Lactobacillus plantarum SK-2，GenBank accession number：DQ480531。 对L．plantarum SK-2发酵产酶条件优化及AI产生机理探讨，结果表明，5 g/L葡萄糖、玉米浆为碳源和氮源时，AI酶活最高；有机氮源效果优于无机氮源；发酵条件优化结果：发酵初始pH 7.0，培养温度37℃，接种量3％，培养时间12 h；L-5可拉伯糖是AI产生的最适诱导物。 经过溶菌酶处理、超声波破碎、硫酸铵沉淀、DEAE-SepharoseCL-6B Fast Flow离子交换色谱和Sepharose CL-6B凝胶过滤等步骤，纯化得到LPAI(Lactobacillus plantarumSK-2 AI)，SDS-PAGE呈现单一条带，HPLC检测纯度达96％，比酶活升高21倍，达到253 U/mg，回收率11％。由SDS-PAGE得到LPAI相对亚基分子质量为59.6 k，而凝胶过滤色谱求得LPAI的相对分子量约为172.3k，因此，推断LPAl分子内有3个亚基，是一种三聚体酶。 纯化的LPAI最适反应温度为50℃，最适反应pH为7.0。稳定性实验表明，在50℃条件下保温2 h，酶活保持100％；在pH 4.5-8.5环境(50℃)保存1 h后测定残余酶活在80％以上，表明酶在pH 4.5-8.5范围内稳定。 Al<'3+>，K<'+>和Na<'+>对酶活几乎没有影响，而Mn<'2+>，Fe<'2+>，Fe<'2+>，Ca<'2+>，Ba<'2+>和Ze<'2+>增强了酶活，Mn<'2+>增强酶活最大，添加20 mmol/L Mn<'2+>酶活力最高；EDTA、Cu<'2+>，Co<'2+>，Ag<'+>，pb<'2+>和Mg<'2+>则分别对酶产生了不同程度的抑制作用，而Hg<'2+>完全抑制了酶活。 LPAI最适底物为L-阿拉伯糖，其次为D-半乳糖，另外，LPAI对海藻糖、木糖和果糖也具有催化作用；不同糖醇对LPAI均产生了抑制作用，木糖醇、甘露糖醇抑制作用较弱，而L-阿拉伯糖醇则完全抑制了酶活。采用Lineweaver-Burk作图法，求得LPAI作用于D-半乳糖和L-5可拉伯糖的特征常数分别为K<,m> 119 mmol/L，V<,max>5.6μmol/min/L和30 mmol/L，352.7μmol/min/L。 纯酶N-端结构前十个氨基酸残基连接依次为：MLSVPDYEFW，发现与Lactobacillusplantarum、Lactobacillus pentosus来源的AI一致；进化同源性表明乳酸菌来源的AI氨基酸序列高度保守。 LPAI在不同pH环境下紫外-可见扫描发现，在280 nm吸收峰主要是色氨酸残基，随pH增加，280 nm吸收峰强度增加，且吸收峰波长有轻微红移，表明色氨酸基团有可能从疏水区移动或翻转到酶蛋白分子外部。 ApoLPAI(脱除Mn<'2+>)加入10 mM Mn<'2+>时，LPAI酶活又恢复到原来的水平。HoloLPAI(原酶)和ApoLPAI进行差示扫描量热分析表明，HoloLPAI热稳定性高于ApoLPAI，因此认为LPAl分子中结合的Mn<'2+>对维持酶活力至关重要，而且其与酶蛋白结合形成的特殊构象对酶的热稳定性也起着重要作用。 LPAI荧光分析表明，激发光波长为295 nm时，最大发射荧光强度为335 nm。对荧光产生贡献的色氨酸残基可能位于一个疏水区环境中，除了在335 nm处有一发射峰外，在377nm处也有个小峰。 圆二色性分析表明，HoloLPAI脱除Mn<'2+>后，蛋白质的二级结构发生了显著变化，其中，β-折叠由14.8％减少为0，回转结构由0变为17.4％。随着结构变化，HoloLPAI中更稳定的β-折叠减少，导致．ApoLPAI具有较低活性，耐热性变差。 NBS、PMSF和DEPC化学修饰造成酶活下降，说明构成LPAI活性中心的必需氨基酸残基有色氨酸、丝氨基酸和组氨酸。NBS滴定表明该酶含有9个色氨酸残基，进一步用Levy法分析化学试剂修饰后残余酶活力与时间、修饰剂浓度的关系，计算出活性中心必需色氨酸残基数目为2，组氨酸残基和丝氨酸残基均为1个。 底物保护试验证明：色氨酸残基、丝氨酸残基处在与底物结合部位。组氨酸不处在底物结合位点，可能位于催化活性部位。 酶的荧光淬灭研究发现，加入3 mg/ml半乳糖，酶的发射光谱峰红移至345 nm，峰的强度降低，导致荧光淬灭。同样加入100μmol/L NBS时，且最大吸收峰红移至340 nm,、导致荧光淬灭。 酶经NBS修饰后，α-螺旋从70.2％下降到29.8％，β-折叠则完全消失，回转则从0增加到32.6％。NBS修饰色氨酸残基造成酶活力下降，从二级结构的变化可知，修饰导致底物结合部位的色氨酸残基周围环境发生明显改变，从而造成与底物结合能力下降。 渗透细胞生物转化半乳糖生产塔格糖的工艺：采用50 mg/ml湿细胞，底物浓度为120g/L，反应温度500℃，转化时间96 h，转化率达到42.6％。 通过HPLC分离酶反应产物，进一步采用红外光谱鉴定，证明生物转化半乳糖得到的产物是塔格糖。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词表

声明

第一章绪论

1.1功能性稀有糖

1.1.1稀有糖概念

1.1.2稀有糖研究现状

1.2塔格糖功能特性及在食品中的应用

1.2.1塔格糖结构和理化性质

1.2.2塔格糖代谢途径及安全性

1.2.3塔格糖的功能性质

1.2.3塔格糖在食品中的应用

1.3塔格糖的生产制备

1.3.1塔格糖的自然分布

1.3.2塔格糖化学催化合成

1.3.3塔格糖的生物转化

1.4 L-阿拉伯糖异构酶的研究进展

1.4.1产L-阿拉伯糖异构酶的微生物

1.4.2 L-阿拉伯糖异构酶的研究进展

1.4.3 L-阿拉伯糖异构酶在塔格糖生产中的应用

1.5立题背景及意义

1.6本课题的研究内容

参考文献

第二章生物转化塔格糖乳酸菌的菌株筛选及鉴定

2.1前言

2.2材料与方法

2.2.1主要材料

2.2.2主要仪器

2.2.3实验方法

2.3结果与讨论

2.3.1初筛方法的建立

2.3.2复筛方法的建立

2.3.3酶活力测定

2.3.4菌种鉴定

2.4本章小结

参考文献

第三章L. PLANTARUM SK-2发酵条件优化及产酶机理探讨

3.1前言

3.2材料与方法

3.2.1实验材料

3.2.2主要实验仪器

3.2.3实验方法

3.3结果与讨论

3.3.1发酵培养基优化

3.3.2发酵条件的选择

3.3.3 AI发酵诱导条件及产酶机理

3.3.3乳酸菌L. plantarum SK-2的产酶进程

3.4本章小结

参考文献

第四章L. PLANTARUM SK-2 AI分离纯化与鉴定

4.1前言

4.2材料与方法

4.2.1菌种及保藏方法

4.2.2主要实验材料

4.2.3主要实验仪器

4.2.4主要实验方法

4.3结果与讨论

4.3.1(NH4)2SO4分级沉淀

4.3.2酶等电点确定

4.2.3 DEAE-SepharoseCL-6BFast Folw离子交换色谱

4.2.4 Sepharose CL-6B凝胶色谱

4.2.5 LPAI纯度鉴定及相对分子质量

4.3本章小结

参考文献

第五章L. PLANTARUM SK-2 AI酶学性质研究

5.1前言

5.2材料与方法

5.2.1实验材料

5.2.2主要实验仪器

5.2.3主要实验方法

5.3结果与讨论

5.3.1温度对LPAI催化活性的影响

5.3.2 pH对LPAI酶活及稳定性的影响

5.3.3金属离子对LPAI酶活的影响

5.3.4 Mn2+对LPAI酶活的影响

5.3.5 LPAI的底物专一性及底物抑制剂

5.3.6 LPAI酶反应动力学常数

5.3.7 LPAI氨基酸组成分析

5.3.8 LPAI的N-端结构分析

5.3.9 LPAI的进化同源性分析

5.3.10 LPAI的差热分析

5.3.11 LPAI的紫外-可见光谱吸收

5.3.12 LPAI的荧光光谱

5.3.13 LPAI的圆二色谱

5.4本章小结

参考文献

第六章LPAI分子活性部位的化学修饰和酶反应机理

6.1前言

6.2材料与方法

6.2.1主要材料

6.2.2主要仪器

6.2.3实验方法

6.3结果与讨论

6.3.1各种化学修饰剂对LPAI活性的影响

6.3.2 NBS对色氨酸残基的化学修饰

6.3.3 DEPC对LPAI酶活力的影响

6.3.4 PMSF对LPAI酶活力的影响

6.3.5底物对LPAI化学修饰的保护作用

6.3.6底物和化学修饰对LPAI的荧光淬灭

6.3.7 NBS修饰作用对酶圆二色谱的影响

6.3.8 LPAI催化D-半乳糖反应机理

6.4本章小结

参考文献

第七章渗透细胞生物转化塔格糖及塔格糖初步分离

7.1前言

7.2材料与方法

7.2.1主要材料和仪器

7.2.2实验方法

7.2结果与讨论

7.2.1不同渗透剂处理对酶活的影响

7.2.2甲苯渗透处理细胞条件的优化

7.2.3 pH对渗透细胞和粗酶液的酶活及稳定性影响

7.2.4温度对渗透细胞和粗酶酶活及稳定性影响

7.2.5甲苯渗透细胞对生物转化塔格糖的影响

7.2.6温度对渗透细胞生物转化塔格糖的影响

7.2.7底物浓度对渗透细胞生物转化塔格糖的影响

7.2.8塔格糖初步分离及鉴定

7.3本章小结

参考文献

论文主要结论

论文创新点

附录

致谢

读博期间发表论文