叶酸偶联的载药磁性白蛋白纳米球靶向治疗胶质瘤的实验研究

摘要

第一部分:
　　 载药磁性白蛋白纳米球的制备及表征
　　 目的:
　　 ①研究Fe3O4磁性纳米粒制备及表征;②纳米雄黄的制备及表征;③白蛋白纳米球的制备、工艺优化及表征;④载药的白蛋白纳米球的制备及表征;⑤磁性白蛋白纳米球的制备及表征;⑥载药磁性白蛋白纳米球的制备及表征。
　　 方法:
　　 ①采用化学共沉淀法制备Fe3O4磁性纳米粒，运用透射电子显微镜（transmissionelectronmicroscope，TEM）、X射线衍射分析(x-raydiffraction，XRD)、扫描电子显微镜（scanningelectronmicroscopy，SEM）、能谱仪(energydispersivespectrometer,EDS)、磁感应加热试验对其表征，MTT(methylthiazolyltetrazolium)法检测其生物相容性;②采用化学共沉淀法制备纳米雄黄，运用TEM、SEM、EDS、动态光衍射（dynamiclightscattering，DLS）、荧光光谱测定含砷量等对其表征;③采用去溶剂化-交联法制备普通白蛋白纳米球，运用TEM、SEM、EDS、DLS对其表征;④采用去溶剂化-交联法制备载药的自蛋白纳米球，运用TEM、DLS对其表征、荧光光谱仪测含砷量、计算药物载药量及包封率;⑤采用去溶剂化-交联法制备磁性白蛋白纳米球，运用TEM、SEM、EDS、DLS及磁感应加热试验对其表征、硫氰酸盐分光光度法测含Fe量;⑥采用去溶剂化-交联法制备载药的磁性白蛋白纳米球，运用TEM、SEM、EDS、DLS及磁感应加热试验对其表征、硫氰酸盐分光光度法测含Fe量、荧光光谱仪测含砷量、计算药物载药量及包封率。
　　 结果:
　　 ①制备的Fe3O4磁性纳米粒表征:TEM、SEM检测显示Fe3O4磁性纳米粒为圆形、电子密度高、大小较一致、分散良好;其平均粒径约为20nm;EDS证实制备的Fe3O4磁性纳米粒只含有Fe与O两种元素;XRD显示制备的纳米粒子各衍射峰所对应的面间距（d值）与粉末衍射标准联合会(JCPDS)编制的代表物质为尖晶石型磁性Fe3O4的PDF(PowderDiffractionFile)卡片d值吻合一致;在输出电流20A，输出频率200kHz的交变磁场(alternatingmagneticfield，AMF)作用下不同浓度的Fe3O4磁性纳米粒混悬液能升温到42℃-65℃，且加热50min后温度能恒定在某一水平不发生改变。材料浸提液的细胞毒性试验结果显示不同浓度的Fe3O4纳米粒浸提液作用L929细胞72h后，结果显示该材料对L929细胞毒性为0-1级，均属对细胞无毒性范畴。②自制的纳米雄黄在TEM、SEM检测下为球形，大小较一致，直径约为50-60nm;DLS显示纳米雄黄的水合粒径约为80nm;EDS证实制备的纳米雄黄只含有As与S两种元素;荧光光谱仪测定含砷量大约在2342.4mg/kg。③自制的白蛋白纳米球在TEM、SEM检测下为球形，大小均匀，均＜100nm，平均在80-90nm;DLS显示白蛋白纳米球的水合粒径约为110nm;EDS证实制备的白蛋白纳米球只含有C、N与O三种元素。④TEM检测显示自制的载药白蛋白纳米球为圆形，形态规整，大小均匀，粒径约在120nm;DLS显示其水合粒径约为160nm;荧光光谱仪测定含砷量大约在46mg/kg;药物载药量约为2％，包封率约为72％。⑤自制的磁性白蛋白纳米球在TEM、SEM检测下为球形，大小均匀，平均在30-40nm;DLS显示磁性白蛋白纳米球的水合粒径约为50nm;EDS证实制备的磁性白蛋白纳米球只含有C、N、Fe与O四种元素;在输出电流20A，输出频率200kHz的AMF作用下不同浓度铁含量的磁性白蛋白纳米球能升温到42℃-65℃，且加热40min后温度能恒定在某一水平不发生改变;硫氰酸盐分光光度法测含Fe量平均在3.5mg/ml。⑥自制的载药磁性白蛋白纳米球在TEM、SEM检测下为球形，大小均匀，平均在140nm;DLS显示载药磁性白蛋白纳米球的水合粒径约为200nm;EDS证实制备的载药磁性白蛋白纳米球只含有S、As、Fe与O四种元素;在输出电流20A，输出频率200kHz的AMF作用下不同浓度铁含量的载药磁性白蛋白纳米球能升温到42℃-65℃，且加热50min后温度能恒定在某一水平不发生改变;硫氰酸盐分光光度法测含Fe量平均在3.0mg/ml;荧光光谱仪测定含砷量大约在40mg/kg;药物载药量为约2％，包封率约为70％。
　　 结论:
　　 成功制备了Fe3O4磁性纳米粒、纳米雄黄、白蛋白纳米球、载药的白蛋白纳米球、磁性白蛋白纳米球、载药磁性白蛋白纳米球。
　　 第二部分:
　　 载药磁性白蛋白纳米球偶联叶酸/近红外荧光染料NIR797的制备及表征
　　 目的:
　　 ①研究载药磁性白蛋白纳米球偶联叶酸的制备工艺及表征;②叶酸介导磁性白蛋白纳米球表面近红外荧光染料NIR797的制备工艺及表征。
　　 方法:
　　 ①利用叶酸活性酯与载药磁性白蛋白纳米球表面的活性氨基进行偶联反应，制备叶酸偶联载药磁性白蛋白纳米球（FA-载药磁性白蛋白纳米球）;运用TEM、SEM、DLS及磁感应加热试验对其表征、硫氰酸盐分光光度法测含Fe量、荧光光谱仪测含砷量、计算药物载药量及包封率、动态测定体外释药速率、红外光谱检测叶酸偶联状况;②利用NIR797上的异硫氰酸酯基，在碱性溶液中可以直接与白蛋白纳米球表面的氨基反应，制备磁性白蛋白纳米球偶联NIR797（NIR797-磁性白蛋白纳米球）和叶酸介导磁性白蛋白纳米球偶联NIR797（FA-NIR797-磁性白蛋白纳米球）;运用TEM、SEM、DLS对其表征、紫外可见近红外分光光度计检测近红外荧光染料偶联状况。
　　 结果:
　　 ①自制的FA-载药磁性白蛋白纳米球在TEM、SEM检测下为球形，大小均匀，平均在180nm;DLS显示FA-载药磁性白蛋白纳米球的水合粒径约为220nm;在输出电流20A，输出频率200kHz的AMF作用下不同铁浓度的FA-载药磁性白蛋白纳米球能升温到42℃-65℃，且加热50min后温度能恒定在某一水平不发生改变;硫氰酸盐分光光度法测含Fe量平均在2.2mg/ml;荧光光谱仪测定含砷量大约在35mg/kg;药物载药量为约1.6％，包封率约为62％;体外动态释药速率，计算其累积释放率显示，该材料5小时释药为14.56％，曲线平缓;红外光谱检测到叶酸有偶联。②自制的NIR797-磁性白蛋白纳米球在TEM、SEM检测下为球形，大小均匀，平均在20-30nm;DLS显示NIR797-磁性白蛋白纳米球的水合粒径约为50nm;紫外可见近红外分光光度计检测偶联上NIR797;FA-NIR797-磁性白蛋白纳米球在TEM、SEM检测下为球形，大小均匀，平均在20-40nm;DLS显示FA-NIR797-磁性白蛋白纳米球的水合粒径约为60nm;紫外可见近红外分光光度计检测偶联上NIR797。
　　 结论:
　　 成功制备了FA-载药磁性白蛋白纳米球、NIR797-磁性白蛋白纳米球、FA-NIR797-磁性白蛋白纳米球。
　　 第三部分:
　　 FA-NIR797-磁性白蛋白纳米球的体内外靶向性评价
　　 目的:
　　 从体外细胞水平，探讨FA-NIR797-磁性白蛋白纳米球对大鼠胶质瘤细胞C6的靶向效应，以及利用7.0TeslaMicro-MR仪对叶酸受体介导的靶向投递系统进行监测的可行性;通过动物实验，从在体水平探讨FA-NIR797-磁性白蛋白纳米球对裸鼠荷大鼠胶质瘤的靶向性、安全性，利用7.0TeslaMicro-MR仪、多光谱活体成像系统对其进行无创、实时监测的可行性。
　　 方法:
　　 ①体外实验:将叶酸靶向（FA-NIR797-磁性白蛋白纳米球）、非叶酸靶向（NIR797-磁性白蛋白纳米球）和叶酸抑制组（FA-NIR797-磁性白蛋白纳米球+叶酸）复合纳米球与大鼠胶质瘤细胞C6共孵育24h后，通过普鲁士蓝染色、7.0TeslaMicro-MR仪检测从体外细胞水平观察C6细胞对叶酸受体介导的靶向效应。②体内试验:建立裸鼠荷大鼠胶质瘤皮下移植瘤动物模型。经4-6周肿瘤直径达0.5cm左右始用于试验。对裸鼠进行MRI、近红外多光谱活体扫描。按分组要求，将48只裸鼠随机分成叶酸靶向组、非叶酸靶向组和叶酸抑制组，每组16只，叶酸靶向组经尾静脉注射FA-NIR797-磁性白蛋白纳米球，非叶酸靶向组经尾静脉注射NIR797-磁性白蛋白纳米球，叶酸抑制组经尾静脉注射FA-NIR797-磁性白蛋白纳米球和叶酸，注射剂量均为5mgFe/kg。注射前及注射后不同时点(1h、2h、4h、8h、24h、48h、72h)分别进行MRI成像，测量感兴趣区（肿瘤、肌肉组织）T2WI及T2*WI信号强度，计算信号变化率，最后用SPSS18.0统计软件进行统计、分析;分别进行近红外多光谱活体成像，实时在位监测叶酸靶向、非叶酸靶向和叶酸抑制组复合纳米球在荷瘤鼠体内的动态过程。NIR序列激发（670nm-900nm或740nm-950nm，间隔10nm）。特异性信号应用MaestroTMEX2.10软件进行光谱分离。病理组织学检查:包括常规HE染色、普鲁士蓝染色。
　　 结果:
　　 ①体外实验:普鲁士蓝染色显示叶酸靶向组与C6细胞共孵育后，细胞内大量铁存在;而非靶向组和叶酸抑制组细胞内少见明显铁颗粒的存在。体外MRI成像显示叶酸靶向组与C6细胞共孵育后在T2WI上信号强度不同程度的降低，而菲靶向组与叶酸抑制组与C6细胞共孵育后在T2WI上信号强度无明显降低。②体内试验:在体MRI成像结果显示，注射叶酸靶向组后肿瘤组织不同时间点的T2WI、T2*WI强度及信号变化率均有明显下降，具有统计学差异。而菲靶向组和叶酸抑制组在注射后1h和2h两个时间点的信号亦有轻度下降，但下降幅度较叶酸靶向组小，且持续时间较靶向组短（非靶向组注射后24h的信号强度即恢复至平扫水平，而靶向组注射后24h的信号强度仍然维持在较低水平，且随着时间的延长，信号越来越低）。在体近红外多光谱活体成像结果显示，叶酸靶向组在注射FA-NIR797-磁性白蛋白纳米球1h后，它的的荧光信号主要集中在肝脏部位。在注射24h后，荧光信号开始出现在肿瘤的部位。随着时间的延长，肿瘤的荧光信号变得更强，肝的部位荧光信号开始减弱。在注射72h后，肿瘤位置的信号达至最强。非靶向组和叶酸抑制组在分别注射NIR797-磁性白蛋白纳米球和FA-NIR797-磁性白蛋白纳米球+叶酸1h后，它们的荧光信号主要集中在肝脏部位。在注射24h后，荧光信号仍然在肝脏。随着时间的延长，肿瘤未见有荧光信号。病理学检查:普鲁士蓝染色显示叶酸靶向组肿瘤组织内有较多蓝染的铁颗粒，而非靶向组和叶酸抑制组则几乎未见铁颗粒的存在。
　　 结论:
　　 体外细胞水平FA-NIR797-磁性白蛋白纳米球对大鼠胶质瘤细胞C6具有较好的靶向效应。在体水平FA-NIR797-磁性白蛋白纳米球对裸鼠荷大鼠胶质瘤移植瘤具有良好的靶向性。
　　 第四部分:
　　 FA-载药磁性白蛋白纳米球治疗胶质瘤的体外、体内实验研究
　　 目的:
　　 从体外细胞水平，探讨FA-载药磁性白蛋白纳米球热化疗对大鼠胶质瘤细胞C6的抑制效应;通过动物实验，从在体水平探讨FA-载药磁性白蛋白纳米球热化疗对裸鼠荷C6移植瘤的治疗作用。
　　 方法:
　　 将单纯培养液空白对照组、FA-载药磁性白蛋白纳米球联合AMF热疗组、FA-载药磁性白蛋白纳米球非联合AMF热疗组、载药磁性白蛋白纳米球联合AMF热疗组、载药磁性白蛋白纳米球非联合AMF热疗组、载药白蛋白纳米球组、磁性白蛋白纳米球组作用于C6细胞株，MTT法研究处理后细胞的增殖抑制作用，流式细胞仪(flowcytometry,FCM)测定处理后细胞的凋亡率。细胞法制作裸鼠胶质瘤模型，实验分为7组:第1组为空白对照组，第2组为FA-载药磁性白蛋白纳米球联合AMF热疗组、第3组为FA-载药磁性白蛋白纳米球非联合AMF热疗组、第4组为载药磁性白蛋白纳米球联合AMF热疗组、第5组为载药磁性白蛋白纳米球非联合AMF热疗组、第6组为载药白蛋白纳米球组、第7组为磁性白蛋白纳米球组。实验动物在治疗后进行MR扫描，观察肿瘤的生长情况，测量肿瘤的直径（长径和短径），计算治疗前后每组动物肿瘤的体积变化并计算体积抑制率，实验结束后测肿瘤质量抑制率。
　　 结果:
　　 FA-载药磁性白蛋白纳米球联合AMF热疗作用于大鼠胶质瘤细胞株后对其生长具有强烈的抑制作用并具有诱导其凋亡的作用，MTT结果显示该组细胞的生长抑制率(68.27％)明显高于FA-载药磁性白蛋白纳米球非联合AMF热疗组(50.57％)、载药磁性白蛋白纳米球联合AMF热疗组(44.60％)、磁性白蛋白纳米球组(36.49％)、载药磁性白蛋白纳米球非联合AMF热疗组(25.64％)、载药白蛋白纳米微球组(24.32％)，而空白对照组则对细胞生长无抑制作用。流式结果也显示该组的凋亡率(46.33％)明显高于FA-载药磁性白蛋白纳米球非联合AMF热疗组(36.72％)、载药磁性白蛋白纳米球联合AMF热疗组(34.28％)、磁性白蛋白纳米球热疗组(29.15％)、载药磁性白蛋白纳米球非联合AMF热疗组(17.68％)、载药白蛋白纳米球组(17.12％)，而空白对照组则无凋亡作用。在体实验显示第2组较其他治疗组裸鼠胶质瘤体积小、增长速度慢，中位生存期延长;第2组的质量抑瘤率与体积抑瘤率分别为IM=75.57％和Iv=97.85％，显著高于其它6组，与对照组相比各组间均有统计学差异(P＜0.05)。
　　 结论:
　　 FA-载药磁性白蛋白纳米球在体外可以显著抑制大鼠胶质瘤细胞C6的增殖，诱导细胞凋亡;在体内显著抑制肿瘤生长、延长肿瘤裸鼠中位生存期。

目录

声明

摘要

第一部分 载药磁性白蛋白纳米球的制备及表征

第二部分 载药磁性白蛋白纳米球偶联叶酸／近红外荧光染料NIR797的制备及表征

第三部分 FA-NIR797-磁性白蛋白纳米球的体内外靶向性评价

第四部分 FA-载药磁性白蛋白纳米球治疗胶质瘤的体外、体内实验研究

Part Ⅰ Preparation and Characterization of Drug-Loaded Magnetic Albumin Nanospheres

Part Ⅱ Preparation and Characterization of Drug-Loaded Magnetic Albumin Nanospheres Conjugated Folate／Near-Infrared Fluorescent Dye NIR797

Part Ⅲ Targeting Evaluation of FA-NIR797 Magnetic Albumin Nanospheres in Vitro and in Vivo

Part Ⅳ Experiment Studies of FA-Drug-Magnetic Albumin Nanospheres for the Treatment of Glioma in Vitro and Vivo

英文缩略语名词对照表

前言

综述

第一部分 载药磁性白蛋白纳米球的制备及表征

1．材料和方法

1．1 实验材料

1．2 实验方法

2．结果

2．1 Fe3O4磁性纳米粒表征

2．2 纳米雄黄表征

2．3 白蛋白纳米球的表征

2．4 载药白蛋白纳米球的表征

2．5 磁性白蛋白纳米球的表征

2．6 载药磁性白蛋白纳米球的表征

3．讨论

3．1 Fe3O4磁性纳米粒的制备及表征

3．2 纳米雄黄的制备及表征

3．3 载药磁性白蛋白纳米球的制备及表征

4．结论

第二部分 载药磁性白蛋白纳米球偶联叶酸／近红外荧光染料NIR797的制备及表征

1．仪器和实验试剂

1．1 主要仪器

1．2 主要实验试剂

2．实验方法

2．1 载药磁性白蛋白纳米球偶联叶酸的制备工艺及表征

2．2 叶酸介导磁性白蛋白纳米球表面近红外荧光染料NIR797的制备工艺及表征(FA-NIR797-磁性白蛋白纳米球)

3．实验结果

3．1 FA-载药磁性白蛋白纳米球的表征

3．2 FA-NIR797-磁性白蛋白纳米球及NIR797-磁性白蛋白纳米球的表征

4．讨论

4．1 FA-载药磁性白蛋白纳米球的制备工艺及性能影响因素

4．2 FA-NIR797-磁性白蛋白纳米球的制备工艺及性能影响因素

5．结论

第三部分 FA-NIR797-磁性白蛋白纳米球的体内外靶向性评价

1、仪器、耗材和实验试剂

1．1 细胞株

1．2 实验动物

1．3 主要仪器和耗材

1．4 主要实验试剂

2、实验方法

2．1 肿瘤细胞培养

2．2 细胞形态观察

2．3 不同浓度FA-NIR797-磁性白蛋白纳米球标记C6细胞的的体外观察

2．4 普鲁士蓝染色

2．5 体外MRI扫描

2．6 裸鼠胶质瘤移植瘤模型制作

2．7 FA-NIR797-磁性白蛋白纳米球靶向胶质瘤的MR成像

2．8 FA-NIR797-磁性白蛋白纳米球靶向胶质瘤的多光谱活体成像

2．9 病理学检查

2．10 统计学分析

3、结果

3．1-3．3 肿瘤细胞形态观察及标记浓度摸索

3．4 普鲁士蓝染色

3．5 体外MRI扫描

3．6 模型制作

3．7 FA-NIR797-磁性白蛋白纳米球靶向胶质瘤的MR成像

3．8 FA-NIR797-磁性白蛋白纳米球靶向胶质瘤的多光谱活体成像

3．9 病理学检查

4．讨论

4．1 分子影像学靶向成像的条件

4．2 分子影像学靶向成像

5．结论

第四部分 FA-载药磁性白蛋白纳米球治疗胶质瘤的体外、体内实验研究

1、仪器、耗材和实验试剂

1．1 细胞株

1．2 实验动物

1．3 主要仪器和耗材

1．4 主要实验试剂

2、实验方法

2．1 C6细胞培养

2．2 FA-载药磁性白蛋白纳米球联合磁感应加热对胶质瘤的体外杀伤实验研究

2．3 FA-载药磁性白蛋白纳米球联合磁感应加热对胶质瘤的体内杀伤实验研究

2．4 统计学分析

3．结果

3．1-3．2 FA-载药磁性白蛋白纳米球联合磁感应加热对胶质瘤的体外杀伤实验研究

3．3 FA-载药磁性白蛋白纳米球联合磁感应加热对胶质瘤的体内杀伤实验研究

4、讨论

5、结论

参考文献

博士在读期间发表文章

致谢