基于基因和分子靶向治疗技术的C225/p5HRe-cfosP-iNOs-IFNG磁性白蛋白纳米球治疗肺癌的实验研究

摘要

本文主要从以下几个方面展开论述：
　　第一章 肿瘤治疗基因合成和表达研究:基于乏氧/辐射双调控基因电路技术的p5HRE-cfosp-iNOS-IFNG真核表达质粒的构建与鉴定及其在细胞内的诱导表达
　　目的:构建pYr-ads-5HRE-cfosp-iNOS-IFNG(即p5HRE-cfosp-iNOS-IFNG)真核表达质粒，并对其进行鉴定。评价其在GLC-82细胞中的诱导表达情况。
　　方法:①以pUC57-Simple-cfosp为模板，将cfosp片段酶切下来连接至pYr-adshuttle-8载体得到pYr-ads-8-cfosp真核表达质粒。②以pDONR223-IFNG为模板，PCR扩增IFNG片段（IFNG即IFN-γ的基因片段），然后将其亚克隆至pYr-adshuttle-8载体，构建pYr-ads-8-IFNG真核表达质粒。③将pUC57-Simple-cfosp及目的载体pYr-ads-8-IFNG双酶切，然后进行连接，构建pYr-ads-8-cfosp-IFNG真核表达质粒。
　　结果:①酶切、测序鉴定结果表明每步均得到了目的质粒，测序发现插入片段序列无改变，并且开放读码框正确。②用QT-PCR检测IFN-γ和iNOS基因的相对表达量，结果表明p5HRE-cfosp-iNOS-IFNG与其他质粒相比，表达量最高，与没有乏氧序列的组(⑥pYr-ads-cfosp-iNOS-IFNG)相比，IFN-γ的表达量高了约1.46倍，iNOS的表达量高了2.11倍(p＜0.05)。与没有基因电路的组（⑤pYr-ads-8-5HRE-cfosp-IFNG）相比，IFN-γ的表达量高了约1.32倍(p＜0.05)。
　　结论:①成功构建了基于乏氧/辐射双调控基因电路技术的p5HRE-cfosp-iNOS-IFNG真核表达质粒及中间各用于比较的质粒。并且酶切鉴定、测序鉴定均证实构建成功。
　　②用QT-PCR检测了C-fos启动子的时效性，C-fos启动子在2Gy的X射线诱导24小时后，靶基因的表达量最高。评价了p5HRE-cfosp-iNO S-IFNG在肺癌细胞内的诱导表达，验证了HRE在缺氧环境中对辐射启动子的增强作用，和基因电路技术的有效性。
　　第二章 C225-Fe3O4/p5HRE-cfosp-iNOS-IFNG（靶向载基因磁性白蛋白纳米球）的制备及靶向性研究
　　目的:①制备表征Fe3O4磁性纳米粒，用PEI修饰Fe3O4磁性纳米粒并进行表征，研究PEI-Fe3O4复合物作为基因载体的可行性。②制备载基因磁性白蛋白纳米球及靶向载基因磁性白蛋白纳米球。③鉴定靶向载基因磁性白蛋白纳米球的免疫特性（即靶向性）并观察其转染效率。④从体内外水平，探讨靶向载基因磁性白蛋白纳米球对人肺癌细胞GLC-82细胞的靶向效应。
　　方法:①采用化学共沉淀法制备Fe3O4磁性纳米粒，聚乙烯亚胺(PEI)对其进行表面修饰。②采用透射电镜(transmission electron microscope，TEM)，ZETASIZER3000激光粒度分析仪，傅立叶红外光谱(fourier transform infraredspectroscopy，FTIR)对修饰前后纳米粒进行表征。③琼脂糖凝胶电泳检测PEI-Fe3O4结合DNA的情况。利用pEGFP-C1观察PEI-Fe3O4介导外源基因转染的效率。④采用去溶剂化-交联法制备载基因磁性白蛋白纳米球，用异型双功能交联剂SPDP耦连纳米球和西妥昔单抗(C225)，制备成靶向载基因磁性白蛋白纳米球，运用TEM、ZETA SIZER3000激光粒度分析仪对其表征，在不同时间点测其在PBS缓冲液和RPMI1640培养液中的粒径，评价其稳定性。动态测定其体外释放基因速率。用硫氰酸盐分光光度法测其含Fe量。
　　结果:①制备的Fe3O4和PEI-Fe3O4磁性纳米粒表征:TEM检测显示磁性纳米粒电子密度高、大小较一致，并且修饰前后形态大小差别不大;FTIR结果显示了修饰后纳米粒的特征峰值，证明了PEI的成功吸附;激光粒度分析仪电位分析显示在pH为7的中性环境，Fe3O4纳米粒的zeta电位值为0±0.5mV，而PEI修饰后纳米粒子的电位值为36.3±0.6mV。②琼脂糖凝胶电泳检测到PEI-Fe3O4与DNA结合情况良好;PEI-Fe3O4可将外源基因转染至GLC-82细胞并高效表达。③自制的空载白蛋白纳米球及靶向载基因磁性白蛋白纳米球在TEM检测下为球形，大小均匀，并且在靶向载基因磁性白蛋白纳米球中明显地观察到在电子密度较低的白蛋白纳米球中包裹着电子密度较高的磁性纳米粒。ZETA SIZER3000激光粒度分析仪显示载基因磁性白蛋白纳米球的水合粒径为189.5±2.4nm;靶向载基因磁性纳米球的水和粒径约为211.9±3.1nm。在pH为7的中性环境中，载基因磁性自蛋白纳米球的zeta电位值是-37.9±0.4 mV，而耦联了C225的靶向载基因磁性白蛋白纳米球的电位值为-40.2±0.7 mV。在不同时间点测其在PBS缓冲液和RPMI1640培养液中的纳米球粒径差别不大，稳定性良好。
　　结论:①应用化学共沉淀法已成功制备了Fe3O4磁性纳米粒且PEI成功地修饰于Fe3O4磁性纳米粒。②修饰后的PEI-Fe3O4磁性纳米粒可以作为基因的载体。③成功制备了白蛋白纳米球、载基因磁性白蛋白纳米球，成功耦连了西妥昔单抗与载基因磁性白蛋白纳米球。④靶向载基因磁性白蛋白纳米球具有缓释作用，并且能高效转染人肺癌细胞GLC-82。⑤细胞实验和体内磁共振实验都说明靶向载基因磁性白蛋白纳米球对人肺癌细胞GLC-82具有良好的靶向效应。
　　第三章 基于基因和分子靶向治疗技术的靶向载基因磁性白蛋白纳米球治疗肺癌的体内外实验研究
　　目的:①体外水平探讨靶向载基因磁性白蛋白纳米球治疗人肺癌的作用。②通过动物实验，从体内水平探讨靶向载基因磁性白蛋白纳米球对肺癌的治疗作用。
　　方法:①体外采用CCK8及流式细胞技术测定靶向载基因磁性白蛋白纳米球体外治疗肺癌的效果。并用透射电镜观察细胞超微结构的变化。②建立裸鼠肺癌移植瘤模型，将靶向载基因磁性白蛋白纳米球经尾静脉注射入裸鼠，经辐射3次，6周后处死裸鼠。计算肿瘤体积抑制率和质量抑制率，制作肿瘤组织标本，进行常规病理学检查。③通过血清生化检查和血常规检测及各内脏器官组织病理学观察初步评价靶向辐射基因联合治疗的安全性。
　　结果:①CCK8实验结果显示靶向载基因磁性白蛋白纳米球能明显抑制人肺癌细胞GLC-82的增殖，FCM检测显示其能诱导GLC-82细胞的凋亡，且其效果较其他组显著。透射电镜下可观察到各组细胞均有不同程度的凋亡，细胞内可见磁性材料沉积。②靶向辐射基因联合治疗组的肿瘤质量抑制率和肿瘤体积抑制率分别为82.54％和85.72％,明显高于单抗治疗组(36.51％、34.33％)、辐射放疗组(42.06％、40.89％)、辐射基因联合治疗组(64.29％、65.64％)和靶向辐射联合治疗组(70.63％、72.57％)(p＜0.05)。③各治疗组肿瘤有不同程度坏死，部分坏死灶可见炎性细胞浸润。其中靶向辐射基因联合治疗组坏死程度最严重。可见大片坏死灶，坏死区域呈红染，肿瘤细胞崩解，胞核消失，部分细胞核固缩。其它治疗组也均有不同程度的坏死，程度较靶向辐射基因联合治疗组轻，但也可见肿瘤细胞的密度下降，细胞排列松散，胞浆呈红染。阴性对照组与各治疗组的心肝脾肺肾等内脏组织均没有发现明显的病理学变化。
　　结论:①靶向辐射基因联合治疗能显著抑制培养人肺癌细胞GLC-82的增殖，诱导细胞凋亡。②分子靶向治疗、放疗和基因治疗三者联合治疗肺癌具有明显的协同作用，能有效抑制肺癌的生长，效果优于单一治疗也优于两两联合治疗。
　　第四章 靶向载基因磁性白蛋白纳米球治疗肺癌的分子机制研究
　　目的:从分子水平探讨靶向载基因磁性白蛋白纳米球介导的分子靶向联合基因治疗肺癌的机制。
　　方法:①采用免疫组织化学方法检测治疗后各组肿瘤组织中Bcl-2、Bax、survivin、VEGF、EGFR、PCNA、p53、Ki67蛋白的表达。②采用western blot检测各治疗组中Bcl-2、Ki67、survivin、caspase-3与caspase-8的表达量，使用Gel-Pro32软件对结果进行灰度分析。从分子水平上探讨靶向载基因磁性白蛋白纳米球介导的分子靶向联合基因治疗肺癌的分子机制。
　　结果:①单抗治疗组、辐射放疗组、辐射基因联合治疗组、靶向辐射联合治疗组、靶向辐射基因联合治疗组的Bax蛋白均有升高，但靶向辐射基因联合治疗组上升最明显。而单抗治疗组、辐射放疗组、辐射基因联合治疗组、靶向辐射联合治疗组、靶向辐射基因联合治疗组的Bcl-2、Ki67、p53、PCNA和survivin蛋白均有下降，其中靶向辐射基因联合治疗组下降得最明显。②Wesrem blot的结果显示，各治疗组与阴性对照组相比Bcl-2、Ki67、survivin均有下调，而caspase-3与caspase-8的表达上调。其中以靶向辐射基因联合治疗组最为显著。
　　结论:靶向载基因磁性白蛋白纳米球介导的分子靶向联合基因治疗肺癌的机制可能与下调PCNA、Ki67蛋白表达而抑制肿瘤增殖;抑制Bcl-2、p53、survivin蛋白表达，上调Bax蛋白表达从而诱导肿瘤细胞凋亡;抑制肿瘤新生血管的形成，抑制EGFR表达有关。

目录

声明

摘要

英文摘要

缩略语(Abbreviations)

前言

参考文献

技术路线

文献综述一 肺癌基因治疗的研究进展

文献综述二 基因电路在肿瘤治疗中的研究进展

第一章 肿瘤治疗基因合成和表达研究：基于乏氧／辐射双调控基因电路的p5HRE-cfosp-iNOS-IFNG真核表达质粒的构建与鉴定及其在细胞内的诱导表达

1．实验材料

2．实验方法

3．实验结果

4．讨论

5．小结

参考文献

第二章 C225-Fe3O4／p5HRE-cfosp-iNOS-IFNG(靶向载基因磁性白蛋白纳米球)的制备及靶向性研究

1．实验材料

2．实验方法

3．结果

4．讨论

5．小结

参考文献

第三章 基于基因和分子靶向治疗技术的靶向载基因磁性白蛋白纳米球治疗肺癌的体内外实验研究

1．实验材料

2．实验方法

3．实验结果

4．讨论

5．小结

参考文献

第四章 靶向载基因磁性白蛋白纳米球治疗肺癌的分子机制研究

1．实验材料

2．实验方法

3．实验结果

4．讨论

5．小结

参考文献

致谢

作者简介

博士在读期间发表文章