延边流行株犬瘟热病毒H基因的原核表达及间接ELISA方法的建立

摘要

犬瘟热(Canine Distemper，CD)是由犬瘟热病毒(Canine Distemper Virus，CDV)感染而引起的急性传染病，具有接触性强、发病率和死亡率高等特点，并可引起机体免疫抑制，是危害犬科类动物生命较为严重的传染病之一，严重制约了我国养犬业、经济动物养殖业和野生动物保护业的发展。因此，建立一种快速、高效的特异性检测方法对于该病的防控具有十分重要的意义。
　　本试验采集延边地区自然感染犬瘟热病毒患病犬的组织病料，提取CDV全基因组，利用RT-PCR方法扩增CDV-H基因，将其克隆至pMD18-T simple vector载体，构建重组克隆质粒pMD18T-CDV-H，并将pMD18T-CDV-H与pGEX-4T-1载体经BamHⅠ和XhoⅠ双酶切，构建重组表达质粒pGEX-CDV-H，转化至BL21(DE3)表达菌株，通过对不同温度、IPTG浓度、Amp+浓度和诱导时间等条件的优化进行重组蛋白的表达，利用SDS-PAGE凝胶电泳对表达产物进行分离鉴定。将诱导表达出的重组蛋白进行纯化，利用Western-blot方法分析纯化蛋白的反应原性，并将纯化后的重组蛋白免疫BALB/c小鼠，制备小鼠抗CDV蛋白多克隆抗体，检测其抗体效价，并利用纯化抗原建立间接ELISA方法。
　　结果显示，CDV-H基因全长约为1824 bp，编码607个氨基酸，该序列与近几年GenBank中收录的国内外9株CDV-H基因核苷酸序列同源性为88.9-99.8％，氨基酸序列同源性为85.8-99.5％。经SDS-PAGE鉴定，重组融合蛋白的分子量约为103 Ku，以包涵体形式存在。纯化蛋白经Western-blot分析鉴定，具有良好的反应原性，免疫BALB/c小鼠可诱导其产生抗CDV-H抗体，抗体效价为1∶64，证明该重组表达蛋白具有良好的免疫原性。通过对间接ELISA方法最适条件的筛选，得到重组蛋白最佳包被浓度为6.88μg/mL，血清最佳稀释度为1∶100，抗原最佳包被条件为4℃过夜，血清最佳作用条件为37℃1h，3％脱脂乳的最佳封闭条件为37℃3h，辣根过氧化物酶标记的兔抗犬IgG的最佳稀释倍数为1∶5000，最佳作用条件为37℃1h，底物最佳显色条件为37℃15 min。通过对特异性试验、重复性试验、对比试验和临床样本检测结果的分析，证实本试验建立的间接ELISA方法行之有效，可应用于临床检测。
　　本试验为延边地区犬瘟热病毒疫苗免疫水平的监测提供了一种简便快捷的方法，并为进一步研究犬瘟热病毒H基因的生物学特性奠定了基础。

目录

声明

摘要

前言

1 犬瘟热的研究进展

1．1 犬瘟热的发现与流行病学特点

1．2 病原学

1．3 致病机理

1．4 临床症状和病理变化

1．5 免疫防控研究

2 犬瘟热病毒检测方法的研究进展

2．1 病毒的分离

2．2 动物回归试验

2．3 包涵体检查

2．4 电镜检查

2．5 免疫学检测

2．6 分子生物学检测

3 研究的目的及意义

材料与方法

1 材料

1．1 病料

1．2 试验动物

1．3 载体

1．4 主要试剂

1．5 试验所需主要溶液的配制

1．6 主要仪器设备

2 方法

2．1 引物的设计与合成

2．2 犬瘟热病毒全基因组RNA的提取

2．3 犬瘟热病毒H基因的扩增

2．4 目的基因的纯化回收

2．5 目的基因的克隆与鉴定

2．6 重组表达质粒的构建及鉴定

2．7 重组表达蛋白的诱导表达

2．8 重组蛋白间接EUSA方法的建立

结果

1 犬瘟热病毒H基因的RT-PCR扩增

2 pMD18T-CDV-H重组克隆质粒的鉴定

2．1 重组质粒的PCR鉴定

2．2 重组质粒的双酶切鉴定

3 重组质粒的序列测定及进化分析

4 pGEX-CDV-H重组表达质粒的鉴定

4．1 重组质粒的PCR鉴定

4．2 重组质粒的双酶切鉴定

5 重组质粒的诱导表达

6 重组表达蛋白的可溶性分析

7 重组表达蛋白的纯化

8 重组表达蛋白的Western-blot分析

9 多克隆抗体效价的测定

10 间接EHSA检测方法的建立

10．1 纯化抗原最佳包被浓度的筛选与血清最佳稀释度的筛选

lO．2 纯化抗原最佳包被条件的筛选

10．3 最适封闭液的筛选和最佳封闭时间的筛选

10．4 血清最佳作用时间的筛选

10．5 酶标二抗最佳作用时间和最佳稀释度的筛选

10．6 底物最适显色时间的筛选

10．7 阳性和阴性临界值的确定

10．8 特异性试验结果

10．9 重复性试验结果

10．10 间接ELISA方法与免疫胶体金方法的比较试验结果

10．11 临床样本检测结果

讨论

结论

参考文献

致谢

作者简介