猫杯状病毒GI和GII株群通用抗原表位的串联表达及其间接ELISA方法的建立

摘要

本发明提供一种猫杯状病毒GI和GII株群通用抗原表位的串联表达及其间接ELISA方法的建立。使用原核表达载体，将猫杯状病毒VP1蛋白的多个B细胞抗原进行串联表达。将表达的重组蛋白纯化并作为包被抗原，用于检测猫杯状病毒抗体。与包被全病毒的方法平行比较，显示其检测阴阳性血清的值高度一致。本发明的抗原处理方便，且缩短了试验时间，操作步骤更简单。本发明建立间接ELISA方法，用以检测猫血清中猫杯状病毒的抗体水平，具有重复性好、特异性高的特点，可用于猫杯状病毒血清学调查。因此，本发明提供的基于VP1蛋白B细胞抗原串联表达的猫杯状病毒间接ELISA检测试剂盒非常适合临床大样本的检测，适合大规模推广。

说明书

技术领域

本发明属于生物疫苗和微生物的检测与诊断领域，更具体的涉及一种重组猫杯状病毒变异株与经典株VP1通用抗原表位的串联表达，及其将其用于检测FCV抗体的间接ELISA方法。本发明还涉及所述的重组猫杯状病毒VP1蛋白在制备猫杯状病毒VP1亚单位疫苗以及在制备诊断或检测猫杯状病毒感染的试剂中的应用。

背景技术

猫杯状病毒（Feline Calicivirus,FCV）是猫和其它猫科动物的重要病原体，属于杯状病毒科水疮性病毒属成员，只有一个血清型。FCV 多感染一岁以下的幼猫，潜伏期2~3，天通常引起猫科动物口腔和上呼吸道疾病，临床症状包括鼻炎、结膜炎和口腔溃疡，严重病例可出现支气管炎和肺炎，也可引起关节和肌肉疼痛。近年来，不断有感染 FCV 强毒变异株引起暴发的报道，使得动物感染的死亡率增加，高致病性毒株甚至能引起猫的全身性感染，并导致死亡。临床病猫康复以后仍可长期排毒，是重要的传染源。该病于 1957年首次被Fastier首次从患病猫排泄物中分离，随后陆续从世界很多国家和地区的猫和猫科动物中分离到该病毒，而1997由年王祥生、夏咸柱等首次从我国疑似患病东北虎体内分离到FCV。高玉伟等人2002 年，在我国上海地区动物园老虎和猎豹的口腔以及分泌物中成功分离该病毒，该病很久以来一直在全世界各个地区感染着猫科动物，给宠物行业和动物养殖业带来重大经济损失。

FCV 的基因组为单股正链 RNA（ssRNA），全长约 7.6 kb，分子量为 2.6×106~2.8×106。它既可以作为 m RNA，直接翻译病毒蛋白，又可作为负股 RNA 的模板，进行复制。全基因组共有三个开放阅读框（open reading frame，ORF），ORF1 编码非结构蛋白，包括病毒蛋白酶、RNA依赖性 RNA 聚合酶。ORF2 主要编码衣壳蛋白被命名为VP1，是 FCV 的主要结构蛋白,其基因长约2 007 bp，编码668 aa，其为75 kDa的衣壳前体蛋白，经蛋白酶加工切去14kDa的前导蛋白(Lc)，形成成熟衣壳蛋白VPl大小为62kDa左右。ORF3编码VP2蛋白，大小为12kd。目前且已证实FCV所有的抗原表位均集中于VP1，因此开发FCV抗体诊断的方法均围绕VP1蛋白进行。

当前FCV毒株主要分GI和GII两个株群，其中GI株主要以以高致病性的 Kaos、Air和 UTCVM-NH2 等国外的FCV强毒株为主。GII 株群则为经典株群，而疫苗株也是以GII株为主，我国的FCV 毒株均属于GII株群。但最新的流行病学调查研究，我国GI分离株的分离比例越来越高，这也是当前FCV免疫失败的主要原因。GI和GII株群的主要差异在VP1蛋白，两个株群VP1的氨基酸的同源性为75-80%之间，并存在多处明显的株群特异性点突变。

目前，我国宠物产业在不断地发展，FCV在我国广泛流行，严重制约着猫宠业的发展。FCV引起的疾病发病率和传染性较高，对FCV的防控工作带来巨大的困难。而抗体水平是评价FCV疫苗效果的最重要参数，抗体水平过低则不能保护需要及时补打疫苗。目前监测FCV的抗体水平常用的方法中和实验，但该方法操作复杂、成本高昂故仅限于专业实验室操作。因此，需要建立一种价格低廉、快速、敏感且能简便检测血清样本的FCV抗体的方法。

理论上对于FCV抗体检测可用全病毒包被的形式建立间接ELISA检测方法；也可以用针对VP1重组蛋白的特异性抗体建立的间接ELISA方法。但全病毒包被需大量病毒，成本高且存在散毒风险。单抗制备较为繁琐且费时费力，短期内不能完成。由于FCV的VP1蛋白是该病毒的唯一抗原保护基因，虽然不同株群毒株的序列之间存在差异，但采用VP1蛋白GI和GII株群通用抗原表位可以代替全病毒以及全长的VP1蛋白，理论上可用于检测FCV特异性抗体。

发明内容

本发明的目的在于提供一种特异性好，灵敏度高的重组抗原，该抗原基于Genbank中84株FCV的GI和GII株群的VP1序列，经过预测分析表位并经过验证后获得的通用B细胞表位串联表达后获得，所示氨基酸序列为SEQ ID NO .1所示，其对应的核苷酸序列为SEQ IDNO .2。

为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

利用在线资源 Bepi Pred 1.0b Server，Bcepred 对实验室分离的9株FCV分离株SH19-9、FCV AH1、FCV TH1株等9株以及国内外已经测序的75个毒株进行抗原表位预测分析。Bepi Pred 1.0b Server 预测时抗原表位的打分临界值选为 1，Bcepred 利用亲水性、柔性、可及性的平均值进行筛选，打分临界值选为 0.5。最终选取打分值同时满足两种软件要求且连续的氨基酸数目大于等于 4 的抗原表位（中间间隔氨基酸数目小于等于2 同样满足筛选条件）作为有效抗原表位的代表序列。统计FCV不同毒株共同的B细胞抗原表位，并根据B细胞表位长度在5-40氨基酸之间的原则，共筛选出28条优势抗原表位。将以上抗原表位分别进行多肽合成，然后与FCV阳性血清进行ELISA筛选，并设立阴阳性对照，按评分的高低筛选出17条有效的抗原表位（ELISA值与阴性对照有显著差异）。最后将上述17条潜在表位按照大肠杆菌的密码子偏爱性进行优化并串联表达，每个表位表位之间加入一个柔性linker序列GGGGS,构建成一个多表位串联表达盒。序列为SEQ ID NO .2所示，嵌入pCold I载体，成功构建pCold I △FCV VP1原核表达质粒，并将pCold I △FCV VP1质粒转化至E.coli BL21(DE3)感受态中，使其在E .coliBL21(DE3)菌株中高效表达并纯化，最后获得纯化的FCV VP1重组蛋白。

进一步的，本发明提供所述改造后的重组猫杯状病毒VP1重组抗原在制备预防猫杯状病药物以及在制备检测或诊断猫杯状病毒抗体试剂，特别是ELISA检测试剂中的应用。

本发明的另一个目的在于提供一种包含上述可溶性抗原的间接ELISA抗体检测试剂盒，该试剂盒主要为猫病毒抗体的检测，用于猫抗体水平的监测。

具体的，所述的利用表达的VP1蛋白开发了相应的ELISA检测方法，该方法敏感性好、特异性高。 通过对ELISA方法中的各个参数进行优化分析，最终确认所述方法当抗原浓度为 2 ug/mL，待检血清 1:1000 稀释时，P/N 值最大，阴性临界值（X+3SD）值为 0.341。

优选的，最佳抗原包被浓度为2 ug/ml、最佳一抗血清稀释倍数为1：1000、最佳包被时间4℃过夜、最佳一抗孵育时间37℃ 60min、最佳二抗稀释倍数的确定1：10000、最佳二抗孵育时间的为37℃ 60min、最佳显色时间是37℃15min。

进一步的，本发明提供一种间接ELISA抗体检测试剂盒，鉴定猫是否感染非猫杯状病毒或者检测猫血清中是否含有猫杯状病毒抗体。截短的FCV VP1重组蛋白作为包被抗原，通过条件优化，建立了检测FCV间接ELISA抗体检测方法。

所述试剂盒包括：包被液的组分为碳酸钠 1.58g、碳酸氢钠 2.93g 加去离子水定容至1L，调节PH值为9.6。PBST 缓冲液为含终浓度 0.01%，Tween-20 的 PBS 缓冲液 。2M的硫酸溶液组分22.2mL 98%的H

进一步，本申请提供一种可以预防和/或治疗猫杯状病毒的疫苗，所述疫苗为DNA疫苗或亚单位疫苗，所述疫苗的活性成分为，氨基酸序列如SEQ ID NO .1所示的蛋白片段和/或核苷酸序列为SEQ ID NO .2所示的核苷酸。

有益效果

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

本发明使用的抗原为猫杯状病毒蛋白VP1有效抗原表位的优化蛋白，嵌入到原核载体pCold I的重组抗原pCold I △FCV VP1，该抗原为可溶性抗原并且经诱导表达纯化后，具有灵敏度高，特异性好以及纯度高等特点。同时，pCold I △FCV VP1具有免疫原性，因此是可作为检测试剂盒的包被抗原。

与现有的基于VP1截短蛋白的ELISA方法相比，本发明所选取的抗原表位是经过筛选后获得有效抗原表位，且分布于VP1蛋白的不同区域，理论上可以检测所有针对VP1蛋白所激发的抗体，具有很强的广谱性，在后续使用中有助于降低假阴性的样本比例。此外本发明充分考虑了GI和GII株的差异性，最终选取的表位可以覆盖以上两种亚群的所有毒株。

截短后VP1蛋白表达于沉淀且表达量高以及临床实用性强。本发明制备的ELISA抗体检测试剂盒能够准确检测样品中是否含有猫杯状病毒抗体，同时与全病毒的间接ELISA相比，本发明基于B细胞表位串联表达包被的重组蛋白ELISA试剂盒的特异性与其相当，且灵敏度高，阳性率高，操作简便。

而本发明使用的截短的VP1重组蛋白表达量高且易于纯化进行大量制备，可以实现ELISA检测的包被抗原的大规模使用。

本发明选取FCV VP1的多个B细胞表位区域，并使用Linker序列（GGGGS）将多个片段串联起来。利用本发明的蛋白抗原制备出的ELISA试剂盒，灵敏度高，阳性率高，操作简便，检测时间短，与现有的利用FCV全病毒建立的间接ELISA检测方法相比，具有明显的优势。

该重组蛋白表达量高，为可溶性表达便于纯化，易于大量制备高纯度的重组蛋白。用于ELISA方法建立后特异性、敏感性强，与全病毒的检测效果一致，相较与全病毒该方法操作方便快捷，成本低，且没有散毒的风险。

附图说明

图1为FCV VP1基因B细胞表位对应氨基酸位点示意图。

图2为重组质粒pCold I △FCV VP1基因酶切鉴定结果。

图3为FCV VP1截短重组蛋白SDS-PAGE电泳结果。

图4为FCV VP1截短重组蛋白纯化后SDS-PAGE电泳结果。

图5为表达目的蛋白纯化后的western blot结果，其中M为蛋白Maker，1为阴性对照 2为重组蛋白。

具体实施方式

为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。

实施例 1

根据所选择的FCV不同毒株VP1共同的B细胞抗原表位区域信息如表1所示，使用一个柔性linker序列将不同区域串联起来，并在序列两端引入

表1选择的抗原表位区域信息

2）阳性重组质粒 pCold I △FCV VP1 的构建

将所需的B细胞抗原表位区域用Linker连接，经过密码子优化后在公司进行合成通过

3）目的蛋白的表达

将鉴定的阳性重组质粒pCold I △FCV VP1小提质粒后转化入BL21 大肠杆菌感受态细胞中，挑取单个菌落接种 LB 培养基，培养过夜。取 100μL 菌液加入到 5mL LB 培养基中震荡培养至 OD 值为0.5（0.4-0.6 左右）时，加入 IPTG 16℃诱导，取不同时间段（诱导表达 12h、16h、20h、24h）表达产物 1mL，超声裂解后进行 SDS-PAGE。结果如图 3 所示 。

4）表达产物的纯化

按照步骤 3）中优化的条件进行大规模培养，按照 His 蛋白纯化说明书进行纯化。纯化后同样进行 SDS-PAGE。结果如图 4 所示。

5）纯化蛋白的 western blot 分析

将纯化的蛋白进行 western blot 分析，一抗为 Hi s Mab（1:1000），酶标二抗为羊抗鼠 IgG/ 辣根酶（HRP）（1:10000），按常规步骤做 western-blot，用DAB 显色观察结果。结果如图 5所示。

实施例2 ELISA 方法的建立

用纯化后的重组蛋白为包被抗原制备ELISA 平板，检测猫血清中FCV 抗体水平，并对影响实验的各种条件进行优化选择。具体而言：

a) 抗原包被浓度与血清最佳稀释度

采用矩阵滴定法，横排选择抗体稀释度（1:100、1:200、1:400、1:800、1：1000、1：1200、1：1400、1：1600），纵排选择抗原浓度（1ug/mL、2 ug/mL、4 ug/mL 、8 ug/mL ），每个稀释度重复 3 次，取平均值。结果，当抗原浓度为 2 ug/mL，待检血清 1:1000 稀释时，P/N值最大，因此，最佳抗原包被浓度为 2 ug/mL，抗体最佳稀释度为 1:1000，如表2所示。

表 2 最适抗原包被浓度与血清稀释度的确定

b) 抗原包被时间的确定

用最佳抗原浓度包被酶标板，包被条件为室温作用1h再4℃过夜、室温作用 2h再4℃过夜、37℃作用1h再4℃过夜、37℃作用 2h再4℃过夜、直接4℃作用过夜，结果 4℃作用过夜包被效果最好，如表3所示。

表 3 最适包被条件的确定

c) 血清最佳反应时间加入血清后，反应时间为30min、60min、90min，进行ELISA检测，结果作用 60min 效果最好，如表4所示。

表4血清最佳反应时间的确定

d) 酶标二抗最佳反应时间

加入酶标二抗后，反应时间为30min、60min、90min，进行ELISA 检测，结果作用60min 效果最好，如表5所示。

表5酶标二抗最佳反应时间确定

e) 底物最佳反应时间的确定

加入底物（TMB）后，反应时间为10min、15min、20min ，进行 ELISA 检测，结果作用15min 效果最好，如表6所示。

表6底物最佳反应时间的确定

通过上述优化的步骤筛选，最终确定利用本申请所述的融合抗原所获得的ELISA检测优选步骤具体为：

(1)包被 ：将纯化后的重组蛋白，用抗原包被液稀释至含重组蛋白2ug/mL 的终浓度，每个 ELISA 孔加入 100uL，4℃包被过夜，PBST 缓冲液洗涤 5min，重复三次 ；

(2)封闭 ：每孔加入 5% 脱脂奶粉的PBST 封闭液 100uL，37℃作用 2h，PBST 缓冲液洗涤 5min，重复四次 ；

(3)加待检血清 ：每孔加入 100uL 用PBS稀释 1:1000 倍稀释的猫血清，37℃作用 1h， PBST 缓冲液洗涤 5min，重复四次 ；

(4)加酶标二抗 ：每孔加入100uL 用PBS稀释 1:10000 稀释的兔抗猫IgG/ 辣根酶，37℃作用 1h，PBST 缓冲液洗涤 5min，重复四次 ；

(5)加显色液 ：每孔加入 100uL TMB显色液，37℃作用 15min ；

(6)加终止液 ：每孔加入50uL 终止液，用酶标仪测定OD450 值 ,所述终止液为2M的硫酸溶液 。

f) 最佳 ELISA 临界值的确定

在最佳工作浓度条件下，对收集的 10 份 FCV 抗体阴性的猫血清进行间接ELISA方法检测，确定阴性临界值（X+3SD）值为 0.341如表7所示。

表7最佳 ELISA 临界值的确定

g) 间接 ELISA 的特异性实验

利用所表达的可溶蛋白作为诊断抗原包被 ELISA 方法检测猫细小病毒（FPV）阳性血清、猫疱疹病毒（FHV）阳性血清，所检测 OD450 值均小于 0.341，检测结果均为阴性如表8所示，证明所建立的方法与上述病毒无交叉反应，特异性好。

表8特异性实验

h) 间接 ELISA 的重复性试验

对四份血清进行测定，计算组内、组间的变异系数，结果均在 5% 以内如表9、10所示，表明所建立的间接 ELISA 方法有较好的重复性。

表 9 批内重复性试验

表 10 批间重复性试验

i) 全病毒包被法与本专利建立的表位串联表达包被法比较

随机抽取五份猫血清用全病毒包被建立的ELISA与本专利建立的表位串联表达ELISA 方法进行检测结果如表11所示，显示两种ELISA方法检测结果基本一致。

表11全病毒包被法与本专利建立的表位串联表达包被法比较

j) 临床样品的检测

利用 a）-i）步骤所优化好的条件包被 ELISA 平板，并对 45 份采自上海地区采集的猫血清进行检测，结果可见，16 份未免疫猫血清检测 OD450 值均小于 0.341，用全病毒建立的ELISA方法进行检测与本专利建立的ELISA 方法结果一致，表明本专利建立的ELISA 方法，可用于 FCV 的临床检测。

可以理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据本发明的技术方案及本发明构思加以等同替换或改变，而所有这些改变或替换都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。

〈110〉 中国农业科学院上海兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心上海分中心）

〈120〉猫杯状病毒GI和GII株群通用抗原表位的串联表达及其间接ELISA方法的建立

〈160〉 2

〈170〉 PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 330

<212> PRT

<213> VP1蛋白GI和GII株群通用B细胞表位串联融合蛋白

<400> 1

DDGSITTPEQGTVVGGVIAEPSAQGGGGSTATGKSVDSGGGGSNWGTSETQGGGGGSVDPVQSTSMGGGGSYHLMSDTGGGGSPYARDSNSGGGGSGSMLTHGSVPSDLIPKNSSLWIGNRHWTGGGGSPFVFQANRHGGGGSKDGAKLGIGIATDCIVPGIPDGWPDTTIPSRLTPAGGGGGSGDNSDIATKQQYETADEIKNNTGGGGSRAWGDKKVGGGGSISDNQLVPSNVIDQGGGGSQDNRVSKEVQTSDVTLAILGGGGSIGEEAVGADRDKVVRISVLPETGARGGGGGSLNNYLLAGGGGSIGKLEFGGGGSLASNIRSNM

<210> 2

<211> 990

<212> DNA

<213> VP1蛋白GI和GII株群通用B细胞表位串联融合蛋白的编码序列

<400> 2

GATGACGGCAGCATTACCACCCCGGAACAGGGTACCGTTGTTGGTGGCGTGATTGCGGAGCCGAGCGCGCAAGGTGGTGGTGGATCTACCGCGACCGGCAAGAGCGTGGACAGCGGTGGTGGTGGATCTAACTGGGGTACCAGCGAAACCCAGGGCGGTGGTGGTGGATCTGTGGACCCGGTTCAGAGCACCAGCATGGGTGGTGGTGGATCTTACCACCTGATGAGCGATACCGGTGGTGGTGGATCTCCGTATGCGCGTGACAGCAACAGCGGTGGTGGTGGATCTGGTAGCATGCTGACCCATGGCAGCGTTCCGAGCGACCTGATCCCGAAAAACAGCAGCCTGTGGATTGGTAACCGTCACTGGACCGGTGGTGGTGGATCTCCGTTCGTGTTTCAGGCGAACCGTCACGGTGGTGGTGGATCTAAGGATGGTGCGAAACTGGGTATCGGCATTGCGACCGACTGCATCGTGCCGGGTATTCCGGATGGTTGGCCGGACACCACCATCCCGAGCCGTCTGACCCCGGCGGGTGGTGGTGGTGGATCTGGCGATAACAGCGACATCGCGACCAAGCAGCAATATGAAACCGCGGACGAAATTAAGAACAACACCGGTGGTGGTGGATCTCGTGCGTGGGGCGATAAGAAAGTTGGTGGTGGTGGATCTATCAGCGACAACCAACTGGTGCCGAGCAACGTTATCGATCAGGGTGGTGGTGGATCTCAAGACAACCGTGTGAGCAAAGAAGTTCAAACCAGCGACGTGACCCTGGCGATCCTGGGTGGTGGTGGATCTATTGGCGAGGAAGCGGTTGGTGCGGATCGTGACAAAGTGGTTCGTATTAGCGTGCTGCCGGAAACCGGTGCGCGTGGTGGTGGTGGTGGATCTCTGAACAACTACCTGCTGGCGGGTGGTGGTGGATCTATCGGCAAGCTGGAATTTGGTGGTGGTGGATCTCTGGCGAGCAACATCCGTAGCAACATG