PRV SD株gE基因主要抗原区域原核表达及间接ELISA方法的建立

摘要

参考猪伪狂犬病病毒(PRV)SD株gE基因序列,设计1对引物,通过PCR方法扩增一段包含gE主要抗原表位编码区的618 bp片段,将其用BamHⅠ和XhoL I双酶切后,插入到原核表达载体pET-32a(+)中,转化大肠杆菌BL21(DE3),进行表达、SDS-PAGE电泳、Western-blot检测和纯化;利用表达的PRV SD gE蛋白进行gE-ELISA鉴别检测方法研究.结果发现:gE重组蛋白得到了高效表达,融合蛋白的分子量约为42 ku;表达产物存在于上清液中,表达量可达菌体总蛋白的30%以上,并且能被PRV抗体所识别.将纯化后的gE蛋白作为抗原,以辣根过氧化物酶(HRP)标记的兔抗猪IgG为二抗,建立检测PRV抗体的间接ELISA方法.结果显示:确定的抗原最佳包被浓度为36μg/mL,最佳包被时间为37℃、1 h并4℃过夜,待检血清(1:50稀释)37℃作用1 h,二抗(1:3000)37℃作用1 h.重复性试验、交叉试验证明该方法重复性好、特异性强、灵敏度高.用gE-ELISA和IDEXX gE-ELISA同时对采集的92份猪血清进行平行检测,发现该方法的特异性为85.71%,敏感性为90.63%,二者符合率为89.13%.该方法为我国猪伪狂犬病的鉴别监测提供了一种可供选择的技术手段.