布鲁菌Rev.1株eryA基因的原核表达及间接ELISA方法的建立

摘要

通过对布鲁菌优势抗原eryA基因进行原核表达,在获得目的蛋白的基础上建立以该蛋白为包被抗原的间接ELISA方法.构建原核表达载体pET-30a-eryA,并将其转入大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,镍柱亲和纯化eryA重组蛋白,SDS-PAGE鉴定纯化蛋白,Western-Blotting检测反应原性后建立间接ELISA方法.反应条件优化后,抗原包被浓度为0.3125μg/mL,37℃包被2 h;封闭液为5％猪源明胶,37℃作用2 h;血清稀释度为1:100,37℃作用1 h;酶标抗体稀释度为1:8000,37℃作用45 min.血清稀释度为1:1600时,仍然检测为阳性,证明建立的间接ELISA方法灵敏性良好;其他菌种及病毒经过特异性检测,均为阴性,证明建立的间接ELISA方法特异性良好;通过重复性检测,批间及批内变异系数均小于10％,证明建立的间接ELISA方法重复性良好.检测临床血清样品,建立的方法与试管凝集试验总符合率为95.7％,证明该方法可初步应用于临床诊断.