A型副鸡嗜血杆菌血凝素基因原核表达及间接ELISA方法的建立及应用

摘要

原核表达A型副鸡嗜血杆菌(Haemophilus paragallinarum serotype A;Hpg serotype A)的血凝素蛋白HA,并以HA蛋白为包被抗原,建立血清间接ELISA检测方法.克隆Hpg HA基因,将其克隆至原核表达载体pET-28a(+)中进行重组HA蛋白的诱导表达,对表达产物进行纯化,并进行Western blot鉴定;用纯化后的HA蛋白作为包被抗原,优化反应条件,建立血清间接ELISA检测方法,并进行特异性、灵敏性和重复性试验,最后对临床样品进行检测.原核表达获得大小约为37 ku的重组HA蛋白;West-ern blot结果表明重组蛋白具有良好的特异性和抗原反应性.Hpg间接ELISA优化反应条件为:抗原包被量每孔500 ng,血清以1:200倍稀释作用1 h,酶标二抗以1:2500倍稀释作用1 h,TMB显色时间为10 min.在该优化条件下,OD450≥0.34为阳性,反之为阴性;特异性试验结果表明对鸡新城疫病毒、禽流感病毒、沙门菌、金黄色葡萄球菌、多杀性巴氏杆菌和大肠埃希菌阳性血清检测均为阴性;对85份阳性血清进行检测,敏感性为98.8%;重复性试验结果表明,批内和批间OD450值的变异系数分别1.5%~3.7%和6.5%~8%.用本试验建立的方法对临床上215份鸡血清样品进行检测,阳性率为25.1%.建立的ELISA检测方法可用于Hpg serotype A抗体水平的检测.