苏云金芽胞杆菌4.0718菌株Cry1和Cry2蛋白高产发酵条件的优化

摘要

为了提高苏云金芽胞杆菌4.0718菌株的杀虫晶体蛋白产量，首先采用P1ackett-Burman设计筛选出发酵培养基中影响苏云金芽胞杆菌4.0718 Cry1和总晶体蛋白产量的显著性因子为黄豆饼粉和MnSO4·H2O，Cry2的产量在该配方中无显著性影响因子。然后利用最速上升实验逼近Cry1最大产出区域，找到后续试验中心点。最后通过中心组合设计和响应面优化得到最佳培养基配方为(g/L)：淀粉12，葡萄糖10，豆饼粉11.5，蛋白胨2.5，K2HPO4 2.5，FeSO4·7H2O0.02，MnSO4·H2O 0.02，MgS04O·7H2O 0.25。使Cry1和Cry2产量分别达到0.32 mg/mL和0.11 mg/mL，比原优选配方产量提高了两倍多。该优化配方发酵液对棉铃虫的半致死浓度(LC50)为1.09μL/mL，杀虫活性比原优化配方(LC50为3.10μL/mL)显著提高。 通过单因子优化实验，得到了优化培养基的最佳起始pH为8.0，消泡剂(豆油)的最佳添加量应小于1％。为提高培养密度，采用直接提高培养基初始浓度法，发现高底物浓度对芽孢和晶体蛋白的形成产生了抑制作用，而在调整C/N基础上增加部分碳氮源含量能达到提高晶体蛋白的产量的目的。优化补料高密度工艺，筛选到了最佳补料培养基组成为葡萄糖和牛肉膏粉，最佳补料工艺为：在10、12、14h，分三次，以2：1的碳氮比补加12g/L的营养物质。为开展发酵罐分批补料高密度培养奠定了基础。 通过单因子实验优化将培养基组成中碳氮源调整为葡萄糖18g/L和蛋白胨14.5g/L，优化出发酵最佳培养基配方。

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论文说明：缩略词表

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引言

1.Bt的生长和芽孢、晶体的形成

2.Bt杀虫蛋白与毒力

2.1.伴孢晶体蛋白分类

2.2.晶体蛋白作用机理

2.3.毒力评价方法

3.培养基的筛选

3.1.碳、氮和矿物营养

3.2.利用污泥和有机废水作为培养基

4.培养条件的优化

4.1.PH

4.2.温度

4.3.溶氧

5.高密度培养

6.实验设计方法

7.立题依据和意义

材料与方法

1.材料

1.1.菌株

1.2.培养基

1.3.供试昆虫

1.4.试剂

2.仪器

3.方法

3.1.种子培养法

3.2.摇瓶培养

3.3.发酵罐培养

3.4.生物量的测定

3.5.生长曲线测定

3.6.还原糖的测定

3.7.ICPs含量测定

3.8.杀虫活性测定

结果与分析

1.培养基原料的预处理

2.营养因子对Cry1和Cry2毒素形成的影响

3.最速上升实验逼近Cry1毒素产量最优区

4.响应面法最优化Cry1毒素产量

5.优化后Cry毒素产量和毒力的测定

6.培养基pH对ICPs产量的影响

7.消泡剂对ICPs产量的影响

8.高密度培养的初步研究

8.1.直接增加初始培养基含固量

8.2.补料分批培养

9.发酵罐培养

10.培养基成分改造

10.1.氮源替换

10.2.碳源替换

讨论

1.Bt制剂的毒力和发酵工艺的快速筛选

2.营养因子对晶体蛋白形成的影响

3.晶体蛋白产量的最优化方法

4.高密度培养工艺的研究

结语

参考文献

硕士期间撰写和发表的与本课题相关的学术论文

致谢