蛋清中溶菌酶的高效提取及其定量测定方法研究

摘要

本文采用多种现代分离技术对鸡蛋清中的溶菌酶进行了提取分离，比较了不同方法对分离效果的影响；并利用新兴的共振瑞利散射技术建立了溶菌酶的快速检测方法；另外对溶菌酶酶学性质及其体外抑菌活性进行了初步探讨。主要研究结果如下：
　　 采用离子交换法提取鸡蛋清溶菌酶，考察了离子交换树脂种类、用量、吸附反应时间、洗脱液浓度和洗脱时间等对溶菌酶提取效果的影响，采用三因素三水平正交响应面组合设计进行实验，对提取工艺进行了优化，建立了树脂用量、吸附时间、洗脱液浓度三个提取工艺参数间的数学模型Y=0.339667+0.041X1+0.038375X2-0.021375X3＋0.00925X1X2-0.00425X1X3-0.0105X2X3-0.051583X12-0.068833X22-0.039833X32，得到最佳的提取工艺条件为：树脂用量占蛋清液体积的32％,吸附时间6.5h，硫酸铵洗脱液的质量浓度为9.3％。在此条件下提取的溶菌酶得率为0.324％，酶活力为16300U/mg。
　　 将离子交换法制得的溶菌酶粗品用超滤法除盐，选择截留分子量为10000的聚醚砜膜，跨膜压力设为0.2MPa，搅拌速度为200r/min，研究了超滤除盐过程中浓缩液体积、膜通量以及脱盐率的关系，得出当超滤至浓缩液体积为原始料液体积的10％左右时，脱盐效果最好，可以除去90％以上的硫酸铵，此时溶菌酶得率为0.275％，酶活力为21500U/mg。
　　 此外，本实验还研究了超滤法直接从蛋清液中分离溶菌酶的工艺条件，探讨了跨膜压力、搅拌速度、料液稀释倍数及溶液pH值对膜通量和蛋白质渗透率的影响，得到最佳的超滤条件：0.1mol/LNaCl溶液以1：1(v/v)的比例稀释蛋清液，料液pH值6.5，跨膜压力0.2MPa，搅拌速度200r/min，在此条件下分离鸡蛋清中溶菌酶，得率为0.301％，酶活力为18200U/mg。
　　 以金纳米粒子作探针，建立了共振瑞利散射光谱法定量测定溶菌酶的方法。研究了金纳米-溶菌酶体系的共振瑞利散射（RRS）光谱、非线性散射（SOS和FDS）光谱和吸收光谱特征，并探讨了金纳米粒子与溶菌酶反应的最适宜条件，包括：溶液pH值、金纳米粒子用量、试剂混合顺序以及共存离子等，确定了反应的最优条件，结果表明共存离子对共振瑞利散射法测定溶菌酶的影响很小。本实验还初步探讨了导致体系共振瑞利散射光强度显著增强的原因。该溶菌酶检测方法灵敏度高，检出限为30.1ng/mL，且具有较好的选择性，应用于合成样品和新鲜鸡蛋清样品中溶菌酶含量的测定，结果令人满意。
　　 溶菌酶的酶学特性研究表明：其最适反应pH值约为6，最适反应温度为55℃；溶菌酶在pH值为6-7和温度为20℃-60℃范围内，能较好的保持酶活，且温度变化对酶活力影响很小；另外大部分金属离子能与溶菌酶产生良好的配伍作用，对酶活力影响不大，其中Na+、Ca2+、Mn2+对溶菌酶有一定的激活作用；几种表面活性剂都对溶菌酶活力有一定抑制作用，但抑制作用相对较弱。
　　 溶菌酶的体外抑菌实验表明：其对大肠杆菌、沙门氏菌有很好的抑制效果，在较高浓度下对金黄色葡萄球菌也有一定的抑制作用，对三种菌的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)分别是E.coli0.313mg/mL和0.625mg/mL,Saureus1.25mg/mL和5.0mg/mL,Salmonella0.625mg/mL和1.25mg/mL。

目录

文摘

英文文摘

缩略语表

第一章 文献综述

1 溶菌酶的结构与性质

1.1 溶菌酶的结构与抑菌机理

1.2 溶菌酶的理化性质

2 溶菌酶的分离纯化研究进展

2.1 食盐直接结晶法

2.2 离子交换色谱法

2.3 亲和色谱法

2.4 膜色谱技术

2.5 超滤法

2.6 反胶团萃取法

2.7 膨胀床吸附法

2.8 分子印迹技术

3 溶菌酶的应用研究

3.1 溶菌酶在食品中的应用

3.2 溶菌酶在医学中的应用

3.3 溶菌酶在生物工程中的应用

4 课题构想

4.1 本课题研究意义

4.2 本课题研究内容

第二章 离子交换法提取鸡蛋清溶菌酶

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.2 实验方法

2 结果与分析

2.1 树脂种类对溶菌酶提取效果的影响

2.2 树脂用量对溶菌酶提取效果的影响

2.3 吸附时间对溶菌酶提取效果的影响

2.4 洗脱液浓度对溶菌酶提取效果的影响

2.5 洗脱时间对溶菌酶提取效果的影响

2.6 正交实验结果及模型分析

2.7 溶菌酶粗品的超滤除盐及浓缩

2.8 溶菌酶的得率和活性

3 小结与讨论

第三章 超滤法分离鸡蛋清溶菌酶

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.2 实验方法

2 结果与讨论

2.1 蒸馏水超滤实验

2.2 跨膜压力对溶菌酶分离效果的影响

2.3 搅拌速度对溶菌酶分离效果的影响

2.4 料液稀释倍数对溶菌酶分离效果的影响

2.5 溶液pH值对溶菌酶分离效果的影响

2.6 溶菌酶的得率和活性

2.7 溶菌酶的纯度鉴定

2.8 溶菌酶制品的比较分析

3 小结与讨论

第四章 金纳米粒子做探针共振瑞利散射光谱法测定溶菌酶

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.2 实验方法

2 结果与讨论

2.1 金纳米粒子及其与溶菌酶结合产物的透射电子显微镜图

2.2 共振瑞利散射光谱（RRS光谱）

2.3 吸收光谱

2.4 非线性散射光谱（SOS光谱和FDS光谱）

2.5 溶液pH值对Au-lyz体系RRS散射强度的影响

2.6 金纳米溶液用量对Au-lyz体系RRS散射强度的影响

2.7 试剂加入顺序对Au-lyz体系RRS散射强度的影响

2.8 金纳米粒子与溶菌酶结合产物RRS强度的稳定性

2.9 金纳米粒子与溶菌酶结合产物RRS散射强度增强的机理探讨

2.10 共存物质的影响

2.11 标准曲线的建立

2.12 分析应用

3 小结与讨论

第五章 溶菌酶的酶学特性及其体外抑菌活性研究

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.2 实验方法

2 结果与分析

2.1 pH值对溶菌酶活力的影响

2.2 温度对溶菌酶活力的影响

2.3 溶菌酶活力的pH稳定性

2.4 溶菌酶活力的温度稳定性

2.5 金属离子对溶菌酶活力的影响

2.6 表面活性剂对溶菌酶活力的影响

2.7 溶菌酶对三种供试菌株的抑制作用

2.8 溶菌酶的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)

3 小结与讨论

第六章 结论与展望

1 结论

2 实验创新点

3 展望

参考文献

致谢

发表论文情况