自噬在PBDE-47致PC12细胞线粒体损伤中的作用

摘要

目的：近年来，溴代阻燃剂多溴联苯醚（polybromodiphenyl ethers，PBDEs）的神经毒性越来越受到人们关注，但PBDEs神经毒性的具体作用机制目前仍不十分清楚。本研究旨在探讨PBDEs同系物之一2,2’,4,4’-四溴联苯醚（2,2’,4,4’-tetrabromodiphenyl ethers，PBDE-47）对大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤PC12细胞自噬和线粒体功能的影响，以及自噬可能在线粒体损伤中的作用，为进一步阐明PBDE-47的神经毒性机制提供依据。
　　方法：不同浓度PBDE-47（1~40μmol/L）处理PC12细胞24 h后，采用CCK-8法检测细胞活力，确定后续实验染毒剂量。随后用不同浓度PBDE-47（1μmol/L、10μmol/L和20μmol/L）处理PC12细胞24 h后，使用透射电子显微镜观察细胞的超微结构；采用ATP检测试剂盒检测PBDE-47对细胞ATP水平的影响；JC-1荧光探针标记细胞后用流式细胞仪检测 PBDE-47对细胞线粒体膜电位（mitochondrial membrane potential，MMP）水平的影响；同时使用Western blotting方法检测自噬相关蛋白自噬相关基因7（autophagy related gene7，Atg7），微管相关蛋白1轻链3（microtubule-associated protein1 light chain3，LC3）、P62和单磷酸腺苷激活的蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）–Unc样激酶1（Unc-like kinase1， ULK1）自噬上游调节通路相关分子磷酸化AMPK蛋白（phosphorylated AMPK， p-AMPK）、磷酸化ULK1蛋白（phosphorylated ULK1，p-ULK1）以及线粒体自噬相关蛋白PTEN诱导的蛋白激酶1（PTENinducedputative kinase1，PINK1）、Parkin的表达水平。为探讨PBDE-47影响自噬过程的环节，采用50μmol/L自噬抑制剂氯喹（chloroquine，CQ）联合20μmol/L PBDE-47处理细胞，利用Western blotting方法检测LC3 II蛋白的表达水平。
　　结果：CCK8结果显示，与对照组相比，从5μmol/LPBDE-47染毒组开始，细胞活力显著降低（P<0.05），呈现明显的剂量—反应关系，且从30μmol/LPBDE-47染毒组开始细胞活力低于70%。本研究选择1~20μmol/L PBDE-47的染毒浓度进行后续实验。电镜结果显示，对照组细胞内未见明显异常变化，1μmol/LPBDE-47染毒组细胞结构与对照组细胞结构类似，但在10μmol/LPBDE-47染毒组内则可见明显肿胀的线粒体和大量的自噬体，且在20μmol/LPBDE-47染毒组自噬体数量更多；与对照组相比，10μmol/L和20μmol/LPBDE-47染毒组ATP水平及MMP水平均显著降低（P<0.05）；Atg7、LC3 II和P62蛋白表达水平均显著升高（P<0.05）。CQ处理细胞后，与单独CQ处理组相比，CQ与PBDE-47联合作用组LC3 II的表达显著升高（P<0.05）。与对照组相比，10μmol/L和20μmol/LPBDE-47染毒组p-AMPK和p-ULK1蛋白表达水平显著升高（P<0.05）；同时10μmol/L和20μmol/L PBDE-47染毒组PINK1和Parkin蛋白表达水平与对照组相比显著降低（P<0.05），而1μmol/LPBDE-47染毒组只有Parkin蛋白的表达水平显著降低（P<0.05）。
　　结论：一定剂量的PBDE-47可通过AMPK-ULK1通路诱导PC12细胞自噬，并可通过下调 PINK1/Parkin表达干扰线粒体通过自噬途径的清除，从而促进线粒体损伤。

目录

声明

全文缩写词

前言

1 材料和方法

1.1 主要试剂和仪器

1.2 主要试剂的配制

1.3 细胞培养

1.4 CCK8试验

1.5 细胞内ATP水平检测

1.6 线粒体膜电位的检测

1.7Western blotting检测

1.8 统计学分析

2 结果

2.1 PBDE-47对PC12细胞活力的影响

2.2 PBDE-47对PC12细胞超微结构的影响

2.3 PBDE-47对PC12细胞线粒体功能的影响

2.4 PBDE-47对PC12细胞自噬的影响

2.5自噬抑制剂氯喹（chloroquine，CQ）对PC12细胞LC3 II蛋白表达水平的影响

2.6 PBDE-47对PC12细胞AMPK-ULK1自噬调控通路的影响

2.7 PBDE-47对PC12细胞PINK1和Parkin蛋白表达水平的影响

3 讨论

4 结论

参考文献

综述:PBDEs的发育神经毒性机制研究进展

附录

致谢