调控PC12细胞自噬在氧糖剥夺/再灌注损伤中的作用

摘要

目的：构建PC12细胞OGD/OGD-R模型,观察处理不同时间点自噬现象的发生及进展.了解mTOR/p70S6K信号通路的激活状态并探讨其与Beclin 1介导参与的自噬信号通路间是否存在相关性;判断PC12细胞凋亡与自噬时程联系.探讨进一步药物激活或抑制自噬后对PC12细胞的促存活/死亡的效应.方法：建立PC12细胞OGD/OGD-R模型,Western Blot法检测自噬相关蛋白LC311、Beclin 1,凋亡相关蛋白Bax、aCaspase 3,mTOR(Ser2448)及其下游p70S6k(Thr389)磷酸化水平表达;LC3ll Turnover实验评价自噬潮;免疫荧光、透射电镜法观察自噬体.Rapamycin、3-MA分别干预OGD/OGD-R损伤过程后CCK-8法检测细胞活性,Guava Nexin法检测细胞凋亡.结果:OGD/OGD-R处理均可引起PC12细胞损伤，OGD 3h时达到轻一中度的损伤并作为再灌注起始时间。自噬相关蛋白LC3II,Beclin1表达变化具有一定的时间规律性;LC3II免疫荧光显示正常对照组只有极弱的荧光，OGD 3h时呈点状聚集，R12h时进一步增强并融合呈片状;OGD 3h联合3-MA抑制细胞自噬，LC3II表达减少且点状聚集趋势不明显;E64d+pepstatin A阻断自噬溶酶体降解导致LC3II的积聚;电镜显示OGD 3h,R12h,OGD 3h联合E64d+pepstatin A处理组胞浆内均出现明显双层膜自噬体结构，而OGD3h联合3-MA处理组自噬泡数量明显减少;OGDlOGD-R处理均可上调各时间点自噬流量，其中OGD3-4h及再灌注晚期R12-24h是自噬的高活性期。结论:OGD/OGD-R均能激活PC12细胞自噬和凋亡。Beclin1和mTOR分别介导的自噬相关信号通路在不同应激环境下具有潜在交互调控机制且自噬活性的变化与凋亡进程具有相关性。调控自噬一溶酶体途径在决定OGD/OGD-R损伤应激中PC12细胞命运具有双重作用。