富核糖核酸热带假丝酵母的发酵工艺研究

摘要

核糖核酸（RNA）是一种能参与蛋白质合成及免疫调节等生理功能的生物大分子。随着研究的深入，核糖核酸的应用也越广泛。微生物内富含RNA，尤其是酵母菌株，因此采用酵母发酵法生产RNA是工业生产的有效途径。本文主要从一株热带假丝酵母（Candida tropicalis）AY91009出发，从培养基优化、发酵条件优化及发酵调控三个方面进行了研究，并得出了以下结论： 1.以热带假丝酵母菌株AY91009为实验菌株，糖蜜作为培养基碳源的基础上，采用响应面法优化其发酵培养基，建立了酵母浸粉、氯化铵和ZnSO4?7H2O的二次回归模型，最终确定发酵培养基为：糖蜜14%、酵母浸粉2.90%、氯化铵1.37%、NaH2PO4?2H2O0.10%、MgSO4?7H2O0.20%、FeSO4?7H2O0.05%、ZnSO4?7H2O0.10%，在此培养基中RNA含量为11.58%，比优化前提高了35.60%。 2.在20L通风搅拌发酵罐中，热带假丝酵母的核糖核酸发酵过程，RNA含量的变化明显分为前期的积累（Ⅰ期）和后期的降解（Ⅱ期）两个阶段。发酵条件优化的研究结果表现出：RNA的前期积累和后期降解过程受不同发酵条件的影响，RNA积累（Cmax=87.22mg/g DCW）最适发酵条件为pH5.5、转速600r/min、通气量1.2vvm；最低RNA平均降解速率（rave=1.867mg/(g·h)）的发酵条件为pH4.5、转速400r/min、通气量0.8vvm。在该发酵条件基础上，优化其初始接种量（湿重），结果表现出：接种量越低，最大单位菌体RNA含量（RNAunit）和最终RNAunit含量均是越高。在初始接种量为40g/L时，最高点RNAunit含量为113.30mg/g DCW比对照提高了24.71%，最终细胞内RNAunit为66.93mg/g DCW，干重为32.38g/L。 3.为提高热带假丝酵母的RNA含量，研究了不同补料策略及不同发酵方式对核糖核酸发酵的影响。结果表现为： （1）指数补料策略4-1：第4h开始指数补加糖蜜，能提高单位菌体的RNAunit含量，但因补料体积过大，导致生物量偏低，因此总RNA含量（RNAtotal）浓度不高。而指数补料策略4-2：0h开始指数补加碳源，对菌体的生长更有利。 （2）间歇式补加碳氮源（C∶N=10∶1）的策略，对生物量和RNA都有所提高，最大RNAunit值为123.75mg/g DCW比对照（113.30mg/g DCW）提高了9.22%，发酵终点RNAunit含量为72.62mg/g DCW提高了8.50%，生物量为39.88g/L，RNAtotal为2.90g/L比初始对照提高33.64%。在间歇式补加碳氮源的基础上，比较补加氨基酸、碱基和核苷对其细胞内RNAunit含量的影响，其中补加碱基效果最明显，RNAunit含量为83.44mg/g DCW，比分批发酵初始提高了44.24%，因此补加碱基是最佳的外源营养物质。 （3）分割发酵是以4h为节点对发酵体系进行分割。当分割体积较小时，对生物量影响不大，但RNAunit的降解趋势有所缓解；当分割1/2体积后菌体细胞几乎停止增长，而RNAunit下降的趋势有了改变，还有一定的回升。在采用高初始湿重且两次1/2分割条件（策略5-5）下，最终RNAunit含量达到86.61mg/g DCW，比分批发酵提高了29.40%，说明适度的细胞密度和培养基更新率有利于酵母RNA的积累。 （4）拟连续发酵中，当设定稀释率为0.5h-1和0.6h-1时（均已超过临界稀释率），虽然生物量不断减少，但是RNAunit含量却显著提高，最高可达134.07mg/g DCW，并且RNAunit下降的趋势几乎消失。当设定稀释率0.5h-1同时控温并补加碱基，细胞内RNAunit含量最高可达150.94mg/g DCW，并且RNAunit下降的趋势彻底改变。

目录

声明

第1章 绪 论

1.1 核糖核酸概述

1.2 核糖核酸的生物合成途径

1.2.1 嘌呤核苷酸的合成

1.2.2 嘧啶核苷酸的合成

1.2.3 核苷酸生物合成的补救途径

1.3 核糖核酸的生产菌株

1.4 核糖核酸的应用前景

1.4.1 核糖核酸在医药方面的应用

1.4.2 核糖核酸在食品和保健方面的应用

1.4.3 核糖核酸在其他方面的应用

1.5核糖核酸的工业生产现状

1.6 论文立题依据及研究内容

1.6.1 立题依据

1.6.2 主要研究内容

第2章 热带假丝酵母发酵培养基优化

2.1 引言

2.2 材料与方法

2.2.1 菌株与培养基

2.2.2 主要试剂及仪器

2.2.3 菌种活化及培养条件

2.2.4 发酵培养基单因素优化

2.2.5 响应面分析

2.2.6 生物量的测定

2.2.7 RNA含量的测定

2.2.8 数据分析

2.3 结果与分析

2.3.1 热带假丝酵母形态特征

2.3.2 热带假丝酵母基本性能评价

2.3.3 发酵培养基单因素优化

2.3.4 响应面分析

2.4 小结

第3章 20 L发酵罐的核糖核酸发酵条件优化

3.1 引言

3.2 材料与方法

3.2.1 菌株与培养基

3.2.2 试剂与仪器

3.2.3 菌种活化及培养条件

3.2.4 发酵罐发酵条件的优化

3.2.5 初始接种量优化

3.2.6 分析方法

3.3 结果与分析

3.3.1 发酵罐参数对RNA发酵的影响

3.3.2 基于发酵条件优化下的分批发酵策略

3.3.3 初始接种量对RNA发酵的影响

3.4 小结

第4章 热带假丝酵母核糖核酸补料分批发酵研究

4.1 引言

4.2 材料与方法

4.2.1 菌株与培养基

4.2.2 试剂与仪器

4.2.3 种子制备方法

4.2.4 发酵工艺参数设定

4.2.5 指数补料策略

4.2.6间歇式一次性补料分批发酵

4.2.7 分析方法

4.3 结果与讨论

4.3.1 策略4-1指数补料发酵工艺

4.3.2 策略4-2指数补料发酵工艺

4.3.3 间歇式补加碳源的补料分批发酵

4.3.4 间歇式补加氮源的补料分批发酵

4.3.5 补加RNA前体物质的发酵工艺

4.4 小结

第5章 热带假丝酵母两种核糖核酸发酵工艺探索

5.1 引言

5.2 材料与方法

5.2.1 菌株与培养基

5.2.2 试剂与仪器

5.2.3 种子制备方法

5.2.4 发酵罐参数设定

5.2.5 分割发酵

5.2.6 拟连续发酵

5.2.7 分析方法

5.3 结果与讨论

5.3.1 分割发酵

5.3.2 拟连续发酵

5.4 小结

第6章 结论与展望

6.1 结论

6.2 展望

参考文献

致谢

已发表论文