通过代谢途径分析和基因敲除法构建高产去氢表雄酮生产菌

摘要

去氢表雄酮（DHEA）是重要的甾体药物前体，具有药物活性，并且可合成多种甾体药物，具有极高的市场与经济价值。DHEA的生产主要采用化学合成的方法，而其他的甾体药物前体雄烯二酮（4-AD）与雄二烯二酮(ADD)均有相应的微生物转化菌株进行生物转化法合成，其产量远超过DHEA。目前并没有能够直接转化生成DHEA的菌株，因此关于DHEA的微生物转化法还有待研究。本课题组获得了一株工业生产甾体中间体4-AD的分枝杆菌，本论文以改造分枝杆菌代谢途径来生产DHEA为目标，对此分枝杆菌进行全基因组测序，分析推导其代谢甾体化合物途径，通过分子生物学以及基因工程的方法，对途径中的关键酶胆固醇氧化酶Cho，3β甾醇脱氢酶Hsd，Δ5-3-甾酮异构酶KSI进行研究，并构建出ChoM1,ChoM2，Hsd多种基因敲除分枝杆菌。主要内容总结如下： 1.本文对高产4-AD菌株进行全基因组测序，通过生物信息学与基因组学对基因组进行注释，并推导出其代谢甾醇化合物途径，发现此分枝杆菌有甾醇母核以及支链降解酶系。甾醇母核降解酶系包括胆固醇氧化酶（Cho），3β-甾醇脱氢酶（Hsd），异构酶（KSI），1-2脱氢酶（KstD），9OH-羟化酶（Ksh），支链降解酶系主要包括单氧化酶以及脂肪链β-氧化还原酶。 2.通过蛋白纯化以及结晶筛选，获得了KSI291蛋白的晶体。利用X-ray衍射方法收集并优化结构数据，将KSI291与同源蛋白的结构进行比对，发现KSI291与同源蛋白整体结构相似，活性中心的关键氨基酸突变较多，空腔内的水分子与KSI291的残基S16与Y57能够与底物形成氢键，使KSI291保留催化功能，基于此结构分析，我们提出了KSI291的催化机制。 3.通过对途径中关键酶的分析，我们构建了ChoM1，ChoM2，Hsd敲除载体，通过同源双交换重组的方法获得了ΔChoM1，ΔChoM2，ΔHsd三种单基因敲除型分枝杆菌，并以此基础上获得了ΔChoM1-ChoM2，ΔChoM1-Hsd，ΔChoM2-Hsd三种双基因敲除型分枝杆菌，以及ΔChoM1-ChoM2-Hsd一种三基因敲除型分枝杆菌。三基因敲除型分枝杆菌发酵实验表明还有其他未知酶能够参与甾醇分子C3位羟基氧化反应。

目录

声明

第一章 绪论

1.1 甾体化合物与药物

1.1.1 甾体化合物

1.1.2 甾体药物

1.2 甾体化合物的微生物转化

1.2.1 微生物转化生产甾体药物前体

1.2.2 微生物转化甾体化合物机制

1.3 去氢表雄酮

1.3.1 去氢表雄酮简介

1.3.2 去氢表雄酮作为药物中间体

1.4 基于同源重组的基因敲除

1.5 研究意义与主要内容

1.5.1 研究意义

1.5.2 主要内容

第二章 新金分枝杆菌基因组分析

2.1 实验材料

2.1.1培养基与试剂

2.1.2实验菌株

2.2 实验方法

2.2.1 分枝杆菌基因组的提取

2.2.2 测序文库的制备

2.2.3 基因组的测序与组装

2.2.4 基因预测与注释

2.3实验结果与讨论

2.3.1 基因组的特征

2.3.2 系统发育分析

2.3.3 菌株Mycobacterium HGMS2GL 转化植物甾醇合成4-AD途径分析

2.3.4 高产DHEA菌株的构建策略

2.4 小结

第三章 分枝杆菌中胆固醇C3位氧化反应与C5位双键异构化关键酶的异源表达与鉴定

3.1 实验材料

3.1.1 实验仪器

3.1.2 实验试剂

3.1.3 实验菌种与质粒

3.2 实验方法

3.2.1 分枝杆菌基因组的提取

3.2.2 目标基因片段的获取

3.2.3 目标基因片段的回收

3.2.4 重组蛋白表达质粒的构建

3.2.5 重组蛋白的表达与纯化

3.2.6 重组蛋白的活性鉴定

3.2.7 重组蛋白的结晶与筛选

3.2.8 蛋白晶体结构的解析

3.3 实验结果与讨论

3.3.1 ChoM1、ChoM2、Hsd、KSI228、KSI291、KSI753重组蛋白表达质粒的构建

3.3.2 Cho、Hsd、KSI蛋白表达与分离纯化

3.3.3 Cho、Hsd、KSI的活性鉴定

3.3.4 KSI291晶体结构与反应机制的解析

3.4小结

第四章ChoM1、ChoM2、Hsd基因敲除型分枝杆菌的构建

4.1 实验材料

4.1.1 实验仪器

4.1.2 实验试剂

4.1.3 实验菌种与质粒

4.1.4 培养基

4.2 实验方法

4.2.1 筛选标记引入基因敲除载体

4.2.2 目的基因上下游同源臂的扩增

4.2.3 分枝杆菌基因敲除质粒的构建

4.2.4 分枝杆菌电转化感受态的制备与电转化

4.2.5 同源双交换重组子的筛选与鉴定

4.2.6 多基因敲除菌株的构建

4.2.7 分枝杆菌的发酵与产物鉴定

4.3 实验结果与讨论

4.3.1基因敲除载体的构建

4.3.2 ChoM1、ChoM2、Hsd上下游同源臂的克隆

4.3.3 ChoM1、ChoM2、Hsd基因敲除载体的构建

4.3.4 ChoM1、ChoM2、Hsd基因敲除型分枝杆菌的筛选

4.3.5 多基因敲除型分枝杆菌的构建

4.3.6 敲除型分枝杆菌的发酵产物鉴定

4.4小结

第五章 论文结论与展望

5.1 论文结论

5.2 展望

参考文献

致谢

附录