抑制阴道加德纳菌的乳酸菌的筛选及其生物学特性

摘要

健康女性阴道是一个复杂的微生态系统，定植着各种细菌，包括益生菌和条件致病菌，两者处于平衡状态。但在某些因素作用下，如雌激素水平的降低、性行为、抗生素的使用等，导致阴道内一些条件致病菌如阴道加德纳菌(Gardnerella vaginalis，G.v)过度生长，占优势地位的乳杆菌数量下降，引起菌群失衡，导致阴道疾病感染。其中，细菌性阴道炎(Bacterialvaginosis，BV)是女性最常见的阴道感染疾病之一，传统治疗法是使用甲硝唑和克林霉素，虽然可以有效消除致病菌，但常导致BV复发率偏高，且增强了一些致病菌的耐药性。综上，迫切需要寻找一种微生态疗法，促使阴道微生态平衡恢复正常。大量研究和应用实例已经表明，利用乳杆菌治疗BV是一种可行，高效，且有着广阔发展空间的方法，目前国外学者已经分离出几株对阴道加德纳菌有抑制作用的乳杆菌，而国内阴道乳杆菌活菌制剂（商品名:定君生）仅有一种，即德式乳杆菌DM8909，为丰富候选菌株的多样性，因此迫切需要寻找可作为治疗细菌性阴道炎候选茵的乳酸杆菌。 本研究的主要目的是从健康育龄女性的阴道分泌物中分离对阴道加德纳菌具有抑制作用的乳杆菌，并分析这些乳杆菌的生物学性质。研究内容包括:乳杆菌的分离与鉴定，对阴道加德纳菌具有抑制作用菌株的筛选，筛选菌株对其他常见致病菌的抑菌作用，乳杆菌抑菌物质的初步分析，筛选菌株对Hela细胞的粘附分析以及拮抗阴道加德纳菌粘附Hela细胞的机制研究，最后评价了具有应用潜力菌株的安全性。 研究结果表明:分离得到的18株乳杆菌均具有抑菌活性，其中3号、N7号、15号菌对病原指示菌的抗菌活性最高，对照组MRS中G.v菌落数的lg值为7.26，加入上述3株菌的无细胞上清液后G.v菌落数的lg值分别为5.09、5.42、5.44，加入商业对照菌株DM8909无细胞上清液后G.v菌落数的lg值为5.95。经SPSS数据软件分析得出3株菌的抑茵活性显著高于德式乳杆菌DM8909(p＜0.05)。并且3株乳杆菌对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌也具有明显的抑制作用。将4株菌无细胞上清液pH值调至7.0后，指示菌G.v菌落数变化不大，其lg值基本均在7.5-7.6之间，与对照组差异不显著(p＞0.05)，乳杆菌的抗菌活性基本消失，几乎无抑菌活性。由此表明发酵上清液中的有机酸起到了主要抑菌作用。结合糖发酵试验结果和16S rDNA序列分析，3号、N7号、15号菌均鉴定为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）。通过对4株菌的生物学特性进行研究，初步掌握了其生长特性，并测定了其产酸和产H2O2能力以及在低酸环境中的耐受性。结果显示3株植物乳杆菌发酵24h后的pH值皆在3.50左右，商业对照菌株DM8909的pH值为3.95，说明分离株具有较强产酸能力。其次，检测了乳杆菌产H2O2能力，4株乳杆菌均产H2O2，但含量偏低。酸的耐受性实验中，3株植物乳杆菌在pH3.0培养8h后存活率均高达70％左右，结果表明分离株可以在阴道酸环境中较好存活。 经过上述试验结果，选取3号、N7号和15号菌株为研究对象，采用与人体阴道上皮细胞最相似的Hela细胞作为粘附模型，测定了3株分离株和商业菌株德式乳杆菌DM8909对Hela细胞的粘附能力。结果发现4株乳杆菌对Hela细胞均有较高的粘附能力。进而对乳杆菌拮抗G.v对HeLa细胞粘附机制进行了初步研究，比较了乳杆菌的排除、竞争、取代3种不同作用方式对G.v粘附HeLa细胞的抑制作用。结果表明无论哪种方式下，与对照组相比，乳杆菌对G.v粘附HeLa细胞均具有明显抑制作用，差异显著，但4株乳杆菌之间的拮抗能力无异。3种不同作用方式发现排除作用方式抑制G.v粘附HeLa细胞作用效果较好，而取代实验组中乳杆菌的抑制能力最弱。 最后对分离株进行了部分安全性试验，抗敏试验结果显示，分离株对多数抗生素敏感，对克林霉素、万古霉素、链霉素耐药。溶血性试验结果显示，分离株均不溶血，即γ溶血，对人体无致病性。 本研究获得的3株植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）是正常妇女阴道的原籍菌，具有较强产酸、产H2O2及较强的抑菌作用，且抑菌效果显著高于商业菌株德式乳杆菌DM8909。并且体外细胞粘附试验表明，3株植物乳杆菌具有较强的粘附Hela细胞能力，可以作为治疗细菌性阴道炎(Bacterial vaginosis)的候选菌株进行深入研究。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 立题背景

1．2 细菌性阴道炎

1．3 利用乳酸杆菌对BV致病菌进行控制的理论依据

1．3．1 阴道微生态

1．3．2 乳杆菌作为阴道优势菌群的抑菌机制

1．4 治疗细菌性阴道炎的现状

1．5 本研究的目的及意义

1．6 本研究的技术路线

2 材料与方法

2．1 试验材料

2．1．1 供试菌株

2．1．2 细胞株

2．1．3 培养基

2．1．4 主要溶液的配制

2．1．5 主要试剂及来源

2．1．6 主要仪器与设备

2．2．试验方法

2．2．1 乳酸杆菌的分离纯化及培养

2．2．2 乳杆菌属水平上的鉴定

2．2．3 对阴道加德纳菌具有抑菌活性乳杆菌菌株的筛选

2．2．4 具有抑菌活性乳杆菌的进一步鉴定

2．2．5 乳杆菌培养上清pH对抑菌活性的影响

2．2．6 筛选获得的乳杆菌对其它常见致病菌的抑菌活性

2．2．7 筛选获得的乳杆菌生物学性质分析

2．2．8 乳杆菌粘附Hela细胞能力的检测

2．2．9 分离菌株安全性评价

2．2．10 数据分析与处理

3 结果与分析

3．1 乳酸杆菌的分离纯化及初步鉴定

3．1．1 疑似菌株的分离纯化

3．1．2 分离株的生理生化试验

3．2 对阴道加德纳菌具有抑菌活性乳杆菌菌株的筛选

3．3 筛选获得菌株在种水平上的鉴定

3．3．1 糖发酵试验结果

3．3．2 菌株的16S rDNA序列同源性分析

3．4 乳杆菌发酵上清pH对抑菌活性的影响

3．5 筛选获得的乳杆菌对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌活性

3．6 筛选获得的乳杆菌的生物学特性

3．6．1 菌株的生长曲线

3．6．2 菌株发酵液的pH曲线

3．6．3 菌株产过氧化氢能力的测定

3．6．4 菌株对酸的耐受性

3．7 乳杆菌对Hela细胞的粘附

3．7．1 Hela细胞的复苏

3．7．2 直接镜检法测定乳酸杆菌对Hela细胞的粘附能力

3．7．3 平板菌落计数法测定乳酸杆菌对Hela细胞的粘附能力

3．7．4 乳杆菌拮抗G．v粘附Hela细胞的机制

3．8 安全性评价

3．8．1 乳杆菌对抗生素的敏感性

3．8．2 乳杆菌溶血性试验

4 讨论

4．1 健康妇女阴道的菌群

4．2 抑制阴道加德纳菌的乳杆菌

4．3 分离菌株鉴定方法

4．4 抑菌活性物质的初步分析

4．5 理想活菌制剂应具备的益生特性

4．5．1 乳杆菌发酵pH值

4．5．2 乳杆菌产过氧化氢的能力

4．5．3 乳杆菌的酸耐受性

4．6 体外Hela细胞粘附机制的分析

4．7 安全性评价

5 结论

致谢

参考文献

附录

攻读硕士学位期间发表的学术论文