酶水解结合酶交联处理改善大豆分离蛋白功能特性及其在肉制品中的应用

摘要

本实验以大豆分离蛋白(Soybean Protein Isolates，SPI)为主要研究对象，采用木瓜蛋白酶限制性水解结合TG(Transgl-utaminase，转谷氨酰胺酶)交联处理或者采用TG交联结合木瓜蛋白酶限制性水解两种方式对其进行改性处理。通过测定改性前后大豆分离蛋白的结构特性（紫外光谱、内源荧光光谱、拉曼光谱、圆二色谱、粒径分布、ζ-电势、凝胶排阻色谱和聚丙烯酰氨凝胶电泳(PolyaCrylamide SDS-PAGE，聚丙烯酰氨凝胶电泳)等等）以及功能特性（分散性、乳化性、乳化稳定性等等）的变化规律以及它们之间的相互关系，揭示酶水解结合酶交联处理或者酶交联结合酶水解处理提高大豆分离蛋白功能特性的构效机制。另外，研究经过改性后的大豆分离蛋白在实际生产和加工条件下与肌原纤维蛋白的互作，揭示其对肌原纤维蛋白功能特性的影响;同时，进一步将改性效果最佳的大豆分离蛋白样品添加到火腿肠中，探讨其对产品品质的影响，为开发肉品品质改良专用大豆分离蛋白产品奠定理论基础。主要研究结果如下:
　　(1)低水解度（DH≤2.0％）水解结合TG交联处理能够显著提高大豆分离蛋白的蛋白质分散指数(PDI)、乳化活性(EAI)和乳化稳定性(ESI)(P＜0.05)，特别是DH0.5Cr（水解度DH=0.5％的水解物经过TG交联后）样品的PDI、EAI和ESI达到最大(P＜0.05)。通过对改性大豆蛋白结构特性的测定发现，水解后交联的大豆蛋白紫外扫描图谱的峰强度先增强后减弱，出峰位置发生红移，色氨酸荧光峰位发生蓝移，并且荧光强度减弱，这些现象说明酶改性使蛋白质三级结构发生一定程度的变化，结构变得松散，蛋白质分子变得伸展，有更多的酪氨酸和色氨酸残基暴露出来。通过圆二色谱和拉曼光谱研究表明改性大豆蛋白的二级结构发生了一定变化，其中α-螺旋结构减少，β-折叠结构有所增加。粒径分布、凝胶排阻色谱和SDS-PAGE电泳分析表明，水解样品经过TG交联处理后，样品的粒径变小，水解度越大，交联后的样品＞100KDa的分子含量越高，10～50KDa的分子含量越少，说明先水解后交联的大豆蛋白在一定程度上发生了集聚，形成了一些聚集物。
　　(2)TG交联结合低水解度（DH≤2.0％）水解处理能够显著提高大豆分离蛋白的PDI(P＜0.05)，特别是Cr-DH1.0（大豆蛋白经过TG交联后水解度DH=1.0％）样品的PDI达到最大（P＜0.05），但是TG交联结合限制性水解处理显著降低了大豆分离蛋白的EAI和ESI(P＜0.05)。通过对改性大豆蛋白结构特性的测定发现，先交联后水解的大豆蛋白紫外扫描图谱的峰强度随着样品水解度的增大先增强后减弱，出峰位置呈现先红移再蓝移的趋势，色氨酸荧光峰位先蓝移后发生红移，荧光强度减弱，通过圆二色谱和拉曼光谱研究表明改性大豆蛋白的二级结构发生了一定变化，其中α-螺旋结构和，β-转角结构减少，β-折叠结构有所增加。通过粒径分布、凝胶排阻色谱和SDS-PAGE电泳分析表明:水解样品经过TG交联处理后，样品粒径变大，交联后的蛋白样品水解度越高，＞100KDa的分子含量越少，10～50KDa的分子含量越多，先交联后水解处理的大豆蛋白在一定程度上同样发生了聚集，产生了更多大于100KDa的蛋白分子。
　　(3)经过综合考虑与评定，最终选择具有最优分散性和乳化性的DH0.5Cr改性大豆分离蛋白与肌原纤维蛋白(MPI)进行不同比例的复配，并研究复配后复配蛋白的结构及功能性质的变化。复配蛋白的乳化活力和溶解度随着DH0.5Cr大豆分离蛋白的添加量的增加显著提高（P＜0.05），而复配蛋白的浊度则随着添加量的增加显著降低（P＜0.05），这可能是由于肌原纤维蛋白可以与改性大豆分离蛋白发生结合形成一部分可溶性的聚集体。与此同时，复配蛋白的荧光强度增强，出峰位置无明显变化，紫外光谱出峰位置发生红移，峰值强度随随着DH0.5Cr大豆分离蛋白的添加量的增加而减弱。
　　(4)向火腿肠中添加DH0.5Cr大豆分离蛋白样品后，随着添加量的增加，产品的蒸煮损失比未添加大豆蛋白或添加未改性样品的蒸煮损失显著降低(P＜0.05)，但是当添加量大于2％时（3％或者4％），其蒸煮损失变化不显著（P＞0.05），而产品的a*-值显著降低，L*-值显著提高(P＜0.05)。DH0.5Cr的添加量为3％的肉糜具有良好的乳化效果和均匀的组织状态，加热后，能够形成坚实的凝胶网状结构，从而显著提高产品的硬度、胶黏性、咀嚼性和回复性(P＜0.05)。感官评定的结果显示，DH0.5Cr的添加量为3％的火腿肠虽然色泽改善不明显，但是风味、口感和组织状态均得到显著提高，因此具有良好的可接受性。低场NMR研究发现，拟合后的T2弛豫时间分布为2个主要的峰，随着DH0.5Cr添加量的增加，主要峰T21和T22向快的驰豫方向移动，同时对应的峰面积A21增加，A22显著降低（P＜0.05）。结合相关性分析可以得出T21与蒸煮损失呈显著正相关(r=0.7323)，与硬度显著呈负相关(r=-0.5591)，而与胶黏性、咀嚼性、回复性负相关性很小。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 立题背景

1．2 大豆分离蛋白(SPI)概述

1．2．1 大豆蛋白的组成与结构性质

1．2．2 大豆蛋白的功能性质

1．3 大豆分离蛋白的酶改性研究

1．3．1 大豆分离蛋白改性的方法

1．3．2 大豆分离蛋白限制性酶解改性

1．3．3 木瓜蛋白酶与TG对大豆蛋白的改性

1．4 大豆蛋白在肉制品中的应用

1．4．1 肌原纤维蛋白概述

1．4．2 大豆蛋白在肉制品中的应用

1．5 本课题的研究目的和意义

1．6 本课题的研究内容

2 材料与方法

2．1 原料与设备

2．1．1 材料与试剂

2．1．2 仪器与设备

2．2 实验方法

2．2．1 原料的制备

2．2．2 大豆分离蛋白功能性质的测定

2．2．3 大豆分离蛋白结构性质的测定

2．2．4 改性大豆分离蛋白与肌原纤维蛋白的互作

2．2．5 添加改性后大豆蛋白对火腿肠品质的影响

2．2．6 数据统计分析

2．2．7 实验设计

3 结果与分析

3．1 酶改性处理对大豆分离蛋白功能性质的影响

3．1．1 双缩脲法测蛋白含量的标准曲线

3．1．2 限制性酶解结合TG交联对大豆分离蛋白分散指数(PDI)的变化

3．1．3 限制性酶解结合TG交联的大豆分离蛋白乳化液乳化活力(EAI)和乳化稳定性(ESI)的变化

3．1．4 限制性酶解结合TG交联的大豆分离蛋白乳化液电势的变化

3．2 限制性酶解结合TG交联对大豆蛋白结构性质的影响

3．2．1 限制性酶解结合TG交联改性大豆分离蛋白紫外光谱扫描图谱分析

3．2．2 限制性酶解结合TG交联改性大豆分离蛋白质色氨酸荧光扫描图谱分析

3．2．3 限制性酶解结合TG交联改性大豆分离蛋白拉曼光谱分析

3．2．4 限制性酶解结合TG交联改性大豆分离蛋白圆二色谱(CD)分析

3．2．5 限制性酶解结合TG交联对大豆分离蛋白分子量分布的影响

3．2．6 限制性酶解结合TG交联对大豆分离蛋白粒径的变化的影响

3．2．7 限制性酶解结合TG交联处理的大豆分离蛋白SDS-PAGE分析

3．3 TG交联后限制性酶解对大豆分离蛋白功能性质的影响

3．3．1 TG交联后限制性酶解对大豆分离蛋白分散性的影响

3．3．2 TG交联后限制性酶解对大豆分离蛋白乳化性的影响

3．3．3 TG交联后限制性酶解的大豆分离蛋白乳化液电势的变化

3．4 TG交联后限制性酶解对大豆分离蛋白结构性质的影响

3．4．1 TG交联后限制性酶解的大豆分离蛋白紫外光谱分析

3．4．2 TG交联后限制性酶解的大豆分离蛋白色氨酸荧光扫描图谱分析

3．4．3 TG交联后限制性酶解的大豆分离蛋白拉曼光谱分析

3．4．4 TG交联后限制性酶解的大豆分离蛋白圆二色谱分析

3．4．5 TG交联后限制性酶解对大豆分离蛋白分子量分布的影响

3．4．6 TG交联后限制性酶解对大豆分离蛋白粒径的变化的影响

3．4．7 TG交联后限制性酶解大豆分离蛋白SDS-PAGE分析

3．5 改性大豆蛋白DH0．5Cr与肌原纤维蛋白的复配

3．5．1 改性大豆蛋白DH0．5Cr对肌原纤维蛋白浊度的影响

3．5．2 改性大豆蛋白DH0．5Cr对于肌原纤维蛋白溶解度的影响

3．5．3 改性大豆蛋白DH0．5Cr对于肌原纤维蛋白乳化活力和乳化稳定性的影响

3．5．4 改性大豆蛋白DH0．5Cr对肌原纤维蛋白结构的影响

3．6 添加不同比例SPI及酶改性大豆蛋白对火腿肠产品品质的影响

3．6．1 添加不同比例SPI及酶改性大豆蛋白对火腿肠产品蒸煮损失的影响

3．6．2 添加不同比例SPI及酶改性大豆蛋白对火腿肠产品色差的影响

3．6．3 添加不同比例SPI及酶改性大豆蛋白对火腿肠产品质构特性的影响

3．6．4 添加不同比例SPI及酶改性大豆蛋白对火腿肠产品水分子的弛豫特性影响

3．6．5 蒸煮损失、T21、质构特性的相关性分析

3．6．6 添加不同比例SPI及酶改性大豆蛋白对火腿肠感官评定结果的影响

4 讨论

4．1 限制性酶解结合TG交联对大豆蛋白功能性质的影响

4．1．1 限制性酶解结合TG交联大豆分离蛋白分散指数(PDI)的变化

4．1．2 限制性酶解结合TG交联大豆分离蛋白乳化活力(EAI)和乳化稳定性(ESI)的变化

4．1．3 限制性酶解结合TG交联的大豆分离蛋白乳化液电势的变化

4．2 限制性酶解结合TG交联对大豆蛋白结构性质的影响

4．2．1 限制性酶解结合TG交联改性大豆分离蛋白紫外光谱扫描图谱分析

4．2．2 限制性酶解结合TG交联改性大豆分离蛋白色氨酸荧光扫描图谱分析

4．2．3 限制性酶解结合TG交联改性大豆分离蛋白拉曼光谱分析

4．2．4 限制性酶解结合TG交联改性大豆分离蛋白圆二色谱分析

4．2．5 限制性酶解结合TG交联对大豆分离蛋白聚集性质的影响

4．3 TG交联后限制性酶解对大豆分离蛋白功能性质的影响

4．3．1 TG交联后限制性酶解对大豆分离蛋白分散性的影响

4．3．2 TG交联后限制性酶解对大豆分离蛋白乳化性的影响

4．3．3 TG交联后限制性酶解的大豆分离蛋白乳化液电势的变化

4．4 TG交联后限制性酶解对大豆分离蛋白结构性质的影响

4．4．1 TG交联后限制性酶解的大豆分离蛋白紫外光谱扫描图谱分析

4．4．2 TG交联后限制性酶解的大豆分离蛋白色氨酸荧光扫描图谱分析

4．4．3 TG交联后限制性酶解的大豆分离蛋白拉曼光谱分析

4．4．4 TG交联后限制性酶解的大豆分离蛋白圆二色谱分析

4．4．5 TG交联后限制性酶解对大豆分离蛋聚集性质的影响

4．5 改性大豆蛋白DH0．5Cr与肌原纤维蛋白的复配

4．5．1 改性大豆蛋白DH0．5Cr对肌原纤维蛋白浊度的影响

4．5．2 改性大豆蛋白DH0．5Cr对于肌原纤维蛋白溶解度的影响

4．5．3 改性大豆蛋白DH0．5Cr对于肌原纤维蛋白乳化性的影响

4．5．4 改性大豆蛋白DH0．5Cr对肌原纤维蛋白结构的影响

4．6 添加不同比例SPI及酶改性大豆蛋白对火腿肠品质的影响

4．6．1 添加不同比例SPI及酶改性大豆蛋白对火腿肠蒸煮损失的影响

4．6．2 添加不同比例SPI及酶改性大豆蛋白对火腿肠色差的影响

4．6．3 添加不同比例SPI及酶改性大豆蛋白对火腿肠质构特性的影响

4．6．4 添加不同比例SPI及酶改性大豆蛋白对火腿肠火腿肠水分子的弛豫特性影响

4．6．5 蒸煮损失、T21、质构特性的相关性分析

4．6．6 添加不同比例SPI及酶改性大豆蛋白对火腿肠感官评定结果的影响

5 结论

致谢

参考文献

附录

攻读硕士学位期间发表的学术论文